DNA提取中各种实验试剂作用原理

1、DNA提取中各种实验试剂作用原理1、STE是Tris-Hcl 、EDTA Nacl的混合液。其总体作用是为 DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。Tris.HCl提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后 DNA酶降解DNANaCl，有利于DNA的溶解。2、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate ）使DNA与蛋白质分离，在高温（5565C）条件下裂解细胞，使染色体 离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及 多糖杂质沉

2、 淀，离心后除去沉淀，3、 苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。缺点： 1. 能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分poly（A） RNA。 2. 不能完全抑制RNase的活性。Tris 酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 (酚易溶于氯仿中)5、异戊醇：减少蛋白

3、质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。6、用乙醇沉淀DNA寸，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀 DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。7、为什么在保存或抽提 DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa= 7.2 )和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符

4、合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子 的种类及数量将与 Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因 子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCI (pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris ，不存在金属离子的 干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA 更能稳定 。8、STE是Tris-Hcl 、EDTA Nacl的混合液。其总体作用是为 DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。Tris.

5、HCI提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNANaCI，有利于DNA的溶解。9、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate ）使DNA与蛋白质分离，在高温（5565C）条件下裂解细胞，使染色体 离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及 多糖杂质沉 淀，离心后除去沉淀，10、 苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆 液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似 相溶。

6、蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。缺点： 1. 能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly（A） RNA。 2. 不能完全抑制RNase的活性。Tris 酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 （酚易溶于氯仿中）5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。12、用

7、乙醇沉淀DNA寸，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀 DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。Tris中文品名 : 三羟甲基氨基甲烷 ; 氨基丁三醇 ; 缓血酸胺Tris 结构式英文品名 : Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane英文别名 : 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolTHAM; Tris base; Trometamol通用 CAS : 77-86-1产品纯度:100%(USP药典级)/ 99

8、.9%(实验室技术级)产品级别:USP药典级,符合USP/EP/cGMP寸药物赋形剂的要求分 子 式: NH2C(CH2OH)3分 子 量: 121.14使用用途:生物制药，体外诊断，个人护理及化妆品原料等 保存温度:常温密封避光保存TRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成PH值为6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值随温度变化很大。一般来说，温度每升高一度，PH值下降0.03 o1M TRIS-HCl 6.8 和 1.5M TRIS-HCl 8.8 是 SDS-PAG最常用的试剂。而由TRIS配成的TAE TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE (PH8.0)主要用于溶解 DNA TE 为

9、 Tris 加 EDTA合称。缓冲特性：Tris为弱碱，在室温(25C)下，它的pKa为8.1 ;根据缓冲理论，Tris 缓冲液的有效缓冲范围在 pH7.0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该 pH值的缓冲液。但同时应注意温度 对于Tris的pKa的影响。衍生缓冲液：由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶 解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入 EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓冲液被用 于DNA勺稳定和储存。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“ TAE缓冲液”(Tris/Acetate/EDTA )，而换成硼酸则获得“ TBE 缓冲液”(Tris/Borate/EDTA ) 这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。制备：Tris可以由两步反应生成：先由硝基甲烷生成中间体三羟甲基硝基甲烷(HOCH2)3CNO2然后再由该中间体还原得到Tris 用途： Tris 缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。 Tris 被用