细胞迁移侵袭实验操作步骤Transwell

1、迁移实验(ce 1 l migratio n a s s a y )实验介绍细胞迁移与侵袭实验将 Trans we ll 小室放入培养板中 ，小室内称上室 ，培养板内称下室 ，上 下层培养液以 聚碳酸酯膜 相隔，将研究得细胞种在上室内 ，由于聚碳酸酯膜有通透性 ，下层培 养液中得成分可以影响到上室内得细胞 ，应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜 ，就可 以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。实验步骤：？ 1材料准备：可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8，没包被胶得(C o st e r与C orn i ng公司得也较常用),T ranswe 11迁移实验得细胞培

2、养板2 4孔板。细胞培养板应当与购买得Tra n sw ell小室相配套，B D公司得 Matrige 1 ,无血清DM EM ,(1%胎牛血清)DM E M 与16 4 0培养 基,DM E M完全培养基,1 6 4 0完全培养基(也可加到2 0%血清),无菌P B S,棉签，胰酶,4% 多聚甲醛固定液或者甲醇 ，结晶紫染液 (0、 1%(g/m1 )PB S 结晶紫 )2 步骤与流程2.1 基质胶铺板 ：?用 BD 公司得 Matri ge l 1：8(根据细胞产生 mmp 得量来决定 )稀释,包被 Tr a ns w ell小室底部膜得上室面，置37 C 30min使M a tri g

3、el聚合成凝胶。使用前进行基底 膜水化、2。2制备细胞悬液？制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24h,进一步去除血清得影响、但这一步并不就是必须得。？消化细胞，终止消化后离心弃去培养液,(用P B S洗12遍)，用含BSA得无血清培养基重悬。调整细胞密度至5X105 / m 1、2?。3接种细胞 取细胞悬液1 0 0讪加入Tr ans we II小室。,下层培养液与小室,在种板得时候?培养细胞：常规 24孔板下室一般加入60 0叮含20 % FBS得培养基，特别注意得就是间常会有气泡产生 ,一旦产生气泡 ,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了 要特别留心 ，一旦出现气泡 ，要将小室提

4、起 ，去除气泡 ，再将小室放进培养板。培养1 2 - 4 8 h(主要依癌细胞侵袭能力而定 )。24h较常见，时间点得选择除了要考虑到细胞 细胞侵袭力外 ，处理因素对细胞数目得影响也不可忽视。2。4 结果统计 ?直接计数法 ， “贴壁”细胞计数 ，这里所谓得 “贴壁”就是指细胞穿过膜后 ，可以附着 在膜得下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色 ，可在镜下计数细胞。取出T ranswel 1小室，弃去孔中培养液，用无钙得P BS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当 风干。0?、1 %结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用P BS洗3遍。40 0 倍显微镜下随即五个视野观察细

5、胞，记数。实验材料(1) Tr a n s wel 1 chamber: 2 4 wel 1 , 8.0-卩 m p o re membranes (Corning)(2 )细胞培养相关试剂：无血清培养基，10%血清培养基,PBS , 0。02%EDTA(3) 固定液： 甲醇(4 )染色液：Gie msa染液(5) 封片剂 ： 中性树胶(6 )其她:小镊子,棉棒,载玻片，盖玻片操作步骤(1) 所有细胞培养试剂与T r answ el 1 c hamber放在3 7C温育；(2) 待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS与无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2X

6、 10 /ml; 在下室(即2 4孔板底部)加入6 0 0- 800卩I含10%血清得培养基,上室加 入10015 0卩l细胞悬液,继续在孵箱培养24小时；(4 )用镊子小心取出ch am ber,吸干上室液体,移到预先加入约8 0 0卩l甲醇 得孔中,室温固定 30分钟;(5 )取出chambe r,吸干上室固定液，移到预先加入约8 00卩l Giemsa染液得孔 中, 室温染色 15-3 0 分钟 ;(6) 轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出ch amber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上得细胞 ;(7) 用小镊子小心揭下膜 , 底面朝上晾干 , 移至载玻片上用中性树胶封片 ;(

7、8) 显微镜下取 9个随机视野计数 ,统计结果。注意事项(1) 根据待测细胞体积大小选择合适孔径得chamb er、常用得为8 . 0 卩m孔径(如AGS细胞)，如果细胞体积较大可以考虑用10-卩m孔径；(2) 根据待测细胞得迁移能力强弱调整细胞数与迁移时间。常规 24-we ll chamber接种细胞数约为25X 104/we ll,迁移时间1 2 36小时；由于Corn i ng公司得24-Tr a nswel 1内含1 2个独立得c hambe r,为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块 24孔普通培养板(Cor ni ng);(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T 3细胞无

8、血清培养2 4小时获得得 上清加50卩g/ml F N(F i bron e ctin),具体可查阅相关文献；( 5 ) 细胞悬液加入膜中央 , 尽量保证液面水平 ；(6) 固定染色擦洗时动作小心 ,避免擦去膜底面得细胞。 但一定要充分擦净膜表面上未迁移得细胞 , 以免影响读数。尤其就是膜周边上可用细牙签或小镊子缠 上湿棉花擦洗 , 但要小心避免将膜戳破 ；(7) Ch a mber与膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组与对照组；(8) 充分晾干 , 避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验(c el 1 in v a sio n a s sa y )实验材料(1 )Ma t ri

9、g e 1 ( BD 5mg/m 1 ), 2 0C保存(2) 其余材料同迁移实验操作步骤(1)Matrigel 在4C过夜融化；用4C预冷得无血清培养基稀释 Matri g el至终浓度1m g/ m I,冰上操作；在chamber上室底部中央垂直加入100卩l稀释后得M at r i gel, 3 7C温育4-5小时使其干成胶状；(4 )后续步骤同迁移实验(1 8) 0注意事项(1) Ma t r ig e I在过高或过低得温度均易凝固，因此操作所需枪头与离心管应 提前在4C预冷；(2 )铺胶时保证液面水平，胶得厚度均匀一致，切勿产生气泡；(3) 其她注意事项同迁移试验。其她T r ans

10、w e II做肿瘤侵袭实验得具体步骤 (1)基质胶准备：将冻存于80度冰箱得BD m a trigel 4度过夜(2 4 h),变成液态；？(2) 取300 U l无血清培养基，加入6 0u l(或50u g /每室)Matrigel ,混匀,(4C操作,最好 在冰浴上),加入上室各100ul( 3个室);放入3 7 C培养箱中,孵育4 5h( 5h);此间经?注释:无血清培养基与基质胶按 1:5稀常观察，当出现 白色层”时,说明已经变为固态、 释,每孔加5 0 ul,在3 7C培养箱中1-2 h0(3)消化细胞，无血清培养基洗 3次，计数，配成细胞悬液;?( 4 )用无血清培养基洗 Ma t

11、 rig e I洗1次;每孔加入10 0ul细胞悬液T?(5)下腔室中加入 50 0 ul含有2 0%FBS嗓件培养基；(6 )37 C培养箱中，孵育2 0 24 h ; ?(7)取出tr answ el I用P B S洗2遍，5 %戊二 醛固定，4 C;?(8)加入结晶紫(0、1 %)染色或G iem s a染色(5 1 0 min),室温0o 5h, P B S洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。迁移实验?tr a ns well在24孔板中浸泡1小时；消化细胞,无血清培养基 洗2次,计 数,配成 细胞悬液，每孔加入1 00 U l细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或 其她

12、刺激因子；3 7C培养箱中,孵育 20-24 h ;取出t rans w ell用 P BS洗2遍,5 % 戊二醛固定,4 C ;P BS洗2遍，加入结晶紫(0、1%)染色,室温0、5h, P B S洗2遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察计数 1 0照相,记录。？侵袭实验取 3 0 0 u I无血清培养基 ，加入 3 0 ul (或 50ug / 每室) M a tri g e l ，混 匀,(4 C 操作,最好在冰浴上),加入上室各 10 0u 1( 3 个室)； 放入37 C 培 养箱中，孵育 4-5h ( 5 h ); 消化细胞，无血清培养基洗 3 次，计数，配成 细胞悬 液；用无血清培养基洗 Matrigel洗1 次；每孔加入 1 00u l细胞悬液；下腔室中加 入 60 0ul无血清 条件培养基；37 C 培养箱中，孵育 2 0 -24h ;取出trans well 用P BS洗2遍，5%戊二醛固定