免疫荧光双标法

1、免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用陈绪军 肖明第 吕志前 卢成宝 薛松 袁忠祥 徐根兴 作者单位： 200080 上海市第一人民医院心血管外科细胞性心肌塑型术（ cellular cardiomyoplasty ）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越 来越多的关注 1，在证实移植的人干细胞在缺血/ 损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多， 但多用的是新鲜冰冻切片， 在石蜡心肌切片中应用较少， 而且 多是单一抗原的荧光标记 2。有研究表明， 酪胺信号放大 （ tyramide signal amplifications, TSA）技术可以提高反应的灵敏性役 为此，我们以人心肌

2、石蜡切片标本为例，运用TSA-免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白 （connexin-43 ， Cx-43） 蛋白及肌凝蛋 白（myosin ）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。一、材料与方法1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（ myosin ）多克隆 IgG 抗体购自美国 Chemicon 公司， 标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jacks。n Immunity公司,小鼠抗人Cx-43单克隆抗 体、碘化丙啶（PI）与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma公司，酪胺（

3、tyramide）-coumrian 结合物试剂盒购自美国 PerkinElmer 公司。2标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例 6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4 C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5卩m石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入 0.01 mol/L 的柠檬酸缓冲液 （pH 6.0） 中， 95C，浸泡 30 min, 室温冷却10 min。3. Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法匚勺，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓 冲液（PBS室温洗涤2次，每次5 min。置入3%过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。 再

4、室温PBS洗涤3次，每次5 min。3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人 Cx-43单克 隆 IgG 抗体，4C孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl,0.05%吐温-20 ）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有 HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温 孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺 -coumrian工作液（1 : 50）,避光，室温孵育 15 min。 再次TnT液洗涤3次。4. Myosin 的免疫荧

5、光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法5。兔抗人肌凝蛋白多 克隆IgG抗体（1 : 20）, 37 C孵育1 h , PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆 IgG抗体（1 : 100），避光，室温孵育 1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。5. PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS , 1卩g/ml ）,室温避光孵育 3 min。PBS室温 洗涤 3 次后甘油封片。6. 荧光显微镜观察：运用带有 3 通道的 AX-80 型 Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中 观察 FITC 信号；蓝通道中观察 coumrian 信号；红通道中观察 PI 信号。图像的编辑采用 Advan

6、ced SPOT 软件。二、结果在 3 通道的 AX-80 型 Olympus 荧光显微镜中红、 绿、蓝通道中分别可以观察到 PI 、 FITC 及coumrian的信号，再经 Advaneed SPOT软件叠加得到图14,红色代表PI标记的人心肌 细胞核，绿色代表 FITC 标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为 coumrian 标记的人心肌 Cx-43 蛋白。 图 1 显示为未加 myosin 抗体而加 Cx-43 抗体的人心肌石蜡切片 ; 图 2中均加 myosin 抗体与 Cx-43 抗体 ; 图 3 中加 myosin 抗体而未加入 Cx-43 抗体；图 4 均未加入 myosin 抗

7、体与 Cx-43 抗体。在本研究中，图 1 与图 2 相比，人心肌石蜡切片而加了 myosin 抗体的心肌纤维呈绿色， 这表明心三、讨论1. 心肌石蜡切片的免疫荧光双标记： 中,不加 myosin 抗体的心肌纤维不着色, 肌纤维被成功地标记上抗人 myosin 抗体,而且特异性高。 Cx-43 蛋白位于心肌细胞的周围, 在本研究中由图 1、图 2 与图 3 可以观察到,加 Cx-43 抗体的人心肌 Cx-43 蛋白呈-图1人心肌石蜡切片未加肌凝蛋白抗体而加Cx-43抗体,心肌石蜡切片均加肌凝蛋白抗体与 Cx-43抗体，PI复染图4 复染加肌凝蛋白抗体而未加Cx-43抗体，PI复染 X 200白

8、抗体与Cx-43抗体，PIPI复染 X 200X 200 图3人心肌石蜡切片人心肌石蜡切片均未加肌凝蛋X 200蓝色，而未加Cx-43抗体的人心肌 Cx-43蛋白不着色 抗体。图2与图4相比，加入2种抗体，人心肌纤维 均不显色；这说明本研究在人心肌石蜡切片中采用的免疫荧光双标记的方法是成功的， 特异性高。在本研究中，标记myosin采用间接免疫荧光技术，这种方法较直接免疫荧光技术灵敏。在本研究中，两种一抗分别来源于兔与小鼠，由于二抗是多克隆的，都可以与两种 一抗结合，故必须是先标记Cx-43后再标记 myosin，不能将两种二抗混合在一起加入，否则会出现交叉污染。2. 本研究方法有以下优点：（

9、1）特异性较单荧光标记强。在细胞性心肌塑型术中单荧光标记有一定的假阳性率，而采用本研究的双荧光法，能同时观察到移植的人的干细胞表达两种心肌抗原，假阳性率大大减低。（2） 目前，报道的人心肌免疫荧光双标记的方法较少，而且多需要特殊的设备如激光共聚焦扫描显微镜等 用普通的荧光显微镜就可以，易于掌握、使用方便。3. 心肌石蜡切片免疫荧光双标记的意义：成体心肌细胞再生能力非常弱胞到缺血/损伤的心肌内，以便参与心肌的修复与再生是当前国内外研究的热点 同种属来源的干细胞的分化能力有较大的差异匚,这表明心肌成功被标记上抗人Cx-43与Cx-43蛋白均着色，而不加抗体者 而且1移植干细 匚71。由于不 ,因此

10、，人的干细胞在运用于临床之前，：9：。需要将人的干细胞植入动物心肌内，以观察植入的人干细胞是否分化为人的心肌细胞新鲜冰冻切片相比，石蜡切片可以保持良好的组织形态，但在石蜡切片中运用免疫荧光检出抗原信号的灵敏性明显减低。myosin是心肌肌纤维的重要组成部分，Cx-43又称为闰盘、隙连接蛋白。如果观察到移植的人干细胞表达myosin与Cx-43，那么就可以认定移植的人干细胞向人心肌细胞分化，而且可以在心肌细胞的电兴奋活动中与其他心肌细胞协同收缩匚6。本研究建立了一种人心肌石蜡切片荧光双标记的方法，我们相信这种方法将在研究人的干细胞移植和心肌的修复与再生方面发挥重要作用。参考文献Che n XJ

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16、l stem cells cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Circulation, 2002 ， 105: 93-98.我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是：1）选取一抗时要来源于两种不同的动物， 我用的是来源于 rabbit 和 rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记 的，我用的是 donkey anti-rabbit-FITC绿）和 donkey anti-rat-Tex-Red （红）。2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过 夜比较好，背景比

17、较清晰。3）我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS荧光标记物。4）封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是 10%的正常 donkey 血清。5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。注意几点：1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。这样就要选择相应不同种属来源的二抗， 避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。好的抗体真的还是很重要。2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎 么办？ 这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的 try3）为何免疫双标一般是

18、免疫荧光为主？一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC 法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？ 可以做，过程还可省一步。 但是注意没有二抗的放大效应， 结果可能有时很难出 来。5）免疫双标荧光的图像如何整合？可以用扫描共聚焦， 或者用园子的软件整合。 注意及时照相， 荧光过段时间会淬 灭。免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：1. 免疫双标做得好的基本原则是 ：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗 不同颜色标记，二抗之间无交叉反应2. 抗体的选择 一般根据本实验相关的一些关键词 （抗体名称、 编号、目标动物 种属、实验方法 . ）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究 者们用的哪个公司的什么编号抗体， 不见得知名公司的抗体就一定做得出来， 实 践检验过了的才是金标准。3. 封闭液的选择 封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色 的抗原。所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。 比如，二抗是“驴 抗羊FITC、驴抗兔CY3，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。 免疫双标一抗的 选择主要有两种形式 :第一：一抗种属来源相同：即一抗 A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠； 对于这种情况， 采用的双标方法是顺序法， 即把免