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文档简介

1、Logo Aee冰冻切片步骤很全面冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以 水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过 任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时由于此法不 需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些 组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。1. 取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。2. 速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需 要，一般在 取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降.缩短降温的时间， 减少冰晶的形成。液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切

2、片方法。具体做法是将组织 块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）.如组织块小可适量加 OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当 盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中. 大约10-20S组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机 冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80C。冰 箱贮存备用。3 固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4C。冰箱预冷5- lOmin让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）

3、上 30mino4切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于 低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5- 10pm。切片时，低温室内温度以-15C。一20C。为宜，温度过低组织易破 碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 切好室温放置30min后，入4C。丙酮固定510min,烘箱干燥20mino PBS 洗5minx3o进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用 3%H2O2孵育5-10mint消除内源性过氧化物酶的活性。5免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切 片1小时（此步可不洗）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原 则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸），将切片放 在加了 PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4C。过夜。第二天先将湿盒放到37C。回温lh,然后吸取片上的一抗进行回收，将 切片插入到小染缸PBS冲洗。滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37C。孵育1小 时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5minx3次。滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（I作浓度染色15min）o回收DAPI,滴加5-10Ml抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用

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