原代海马神经元细胞培养

1、原代海马神经元细胞培-CAL-FENGHAL-(YICAI)-Company One 1原代海马神经元细胞培养溶液的配制:(1) 4%多聚甲醛溶液:4g多聚甲醛溶于100ml pH=7. 4的0. 01mol/l PBS 中，混匀过滤，室温保存。(2) 磷酸盐缓冲液(PBS) (0. Olmol D : KH：PO, 0. lg：Na：HPO, 12H：0, 1. 7g； KC1, 0. lg； NaCl, 4. Og,双蒸水加至 500ml, pH二7. 27. 4。用0. 2 m滤膜过滤，4C保存。(3) 1%蛋白酶的配制:用磷酸缓冲液(pH=7. 27. 4)配制成浓度为1%的 胰蛋白酶

2、母液冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上 述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。(5) 解剖液：葡萄糖，3. 0g；蔗糖，7. 5g； NaCl, 8. 0g： KC1, 0. 4g； Na：HP0, 7H：0, 0. 18g； KH：PO., 0. 03g； HEPES, 2. 14g；加双蒸水 1000ml, 调pH二7.07. 4,过滤，4C保存。(6) 种植液：DMEM 79%,胎牛血清，10%；马血清，10%：谷氨酰胺培养液 l%o(7) 饲养液：Neurobasal培养基,97%；谷氨酰胺培养液，

3、1%; B-27,2%o(8) 阿糖胞昔：用双蒸水配制成浓度为1 mg mF的母液储存。用0.2 m 滤膜过滤，-20C储存。使用时，取6 1母液加入2ml培养液中，终浓度 为3 g mF。(根据实验情况调整浓度)大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠(12h) , 75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其 放入盛有解剖液的培养皿中。(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿 中。在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数 小块，放入盛有0.25%胰蛋口酶的培养皿中，将培养皿放入9%C02. 37C消 化 20min(3) 将培养皿中的海马

4、碎片移入离心管中，去除含胰蛋口酶的液体并用种 植液将海马碎片冲洗23遍，终止酶的消化作用。(4) 在离心管中加入2ml的种植液，用口径递减的吹打管轻轻吹打海马碎 片数次，将上清液吸出备用，再加入加1的种植液后，用吸管吹打数次， 将上清液吸出备用，如此反复数次，至海马碎片全部被吹打散开。(每次 吹打10次，吹打时注意不要吹入空气，吹打尽量轻柔)(5) 吸出的上清液再加入种植液调整其浓度，用200 U细胞筛过滤。(6) 将上述滤过的液体混匀后分装入已涂有0. lmg ml-1多聚赖氨酸的96 孔板上，使分散的细胞计数约为0. 3x106 ml-lo然后将96孔板放入 9%C02, 37C细胞培养箱中培养。(7) 12h后观察细胞，镜下可见多数细胞贴壁生长。生理盐水冲洗细胞2 遍以上以去除细胞碎片然后换上已平衡好的饲养液。(8) 培养36h后加入阿糖胞昔3 g ml-1以抑制胶质细胞的分裂生长。(9) 加入阿糖胞昔后12h换液。以后每3d半量换液，饲养至714d可以 进行实验。(10) 或种板40min后，更换饲养液。种板后12h,更换饲养液。然后每3 天半量换液。注：第一种方法细胞纯度高，