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文档简介

1、双缩脲法测定蛋白质浓度生物化学实验一、目的了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 (蛋白质分子中有 -CS-NH2, -CH2-NH2, -CHNH2CH2OH 等基团，这些基团亦可与碱性高价铜呈颜色反应 )，在碱性溶液中蛋白 质与 Cu2+形成紫色配合物，在 540m 处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比， 可用比色法定量测定。双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈 色反应，但Cu2 +离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。三、实验仪器1. 容量瓶 10ml( X6)2

2、试管1.5cm x 15cm( X 8)3吸管5.0ml（ x、3）2.0ml（ X。）4722型（或 7220型）分光光度计。四、实验试剂1、双缩脲试剂：将 0.175gCuSO4 5H20 溶于约 15ml 蒸馏水，置于 l00ml 容量瓶中，加入 30ml 浓氨水 30ml 冰冷 的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 12h,再加蒸馏水至刻 度，摇匀备用。2、卵清蛋白液：约 lg 卵清蛋白溶于 l00ml0.9% NaCI溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据 测定结果，用0.9% NaCI溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2rng/ml。亦可用2mg

3、/ml 的牛血清白蛋白溶液。3、未知液：可用酪蛋白配制。五、操作1 、标准曲线的绘制：将 6 只 10ml 容量瓶编号，按下表加入试剂，即得 6种不同浓度的蛋白质溶 液。表双缩脲法测定蛋白质浓度标准曲线的绘制瓶号 mg/ml 卵清蛋白液体积 ml1.02.03.04.05.06.0 蒸馏水稀释至刻度稀释至刻度稀释至刻度稀释至刻度稀释至刻度稀释至刻度蛋白质浓度 (mg/ml)0.20.40.60.81.01.2取干净试管 7 支，按0、1、2、3、4、5、6编号，16号管分别加人上述不同浓度的蛋白质溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml 蒸馏水。各管加人双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫红色出现，用 540nm光测定各管吸光度（须在显 色后 30min 内比色， 30min 后可能有雾状沉淀产生；各管由显色到比色的时间 尽可能一致 ）。绘制浓度一吸光度曲线。2、样液测定：取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml（样品液浓度控制在0.05-1.25mg/ml 范围内 ）置试管内，加入双缩脲试剂2. 0ml，混匀，测其540hm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓 度。六、思考题

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