五氯硝基苯降解细菌的分离鉴定及菌株DH19的降解特性、代谢途径和SufB基因功能研究

1、五氯硝基苯降解细菌的分离鉴定及菌株 DH19的降解特性、代谢途径和 SufB 基因功能研究五氯硝基苯是一种典型的有机氯类保护性杀菌剂 , 因其杀菌谱广、价格低廉 且药效持久等特点 ,在生产中应用广泛。但其残留期长 ,难降解且在环境中能代谢 产生多种有毒类物质 , 对农产品质量及环境安全造成严重威胁 , 制约了我国农产 品的出口贸易。因此, 发展生物修复对降低和消除其环境污染意义重大。本研究从常年施用 五氯硝基苯的人参地块采集土壤样品 , 从中分离并筛选出能够以五氯硝基苯为唯 一碳源进行生长的细菌菌株 , 并对其进行纯化、鉴定 ,明确其降解特性 ,优化其发 酵条件, 研究菌株的降解机制及其在降解

2、五氯硝基苯的过程中产生的代谢产物 , 对降解五氯硝基苯的代谢途径进行分析推断 , 并通过基因重组的方法对降解基因 的功能进行研究。本研究为提高五氯硝基苯污染的生物修复效率提供理论支持和合理依据 , 为 降解菌的产业化菌剂开发利用奠定基础 , 提高我国人参等多种植物产品的质量 , 解除我国的作物出口贸易受到严重制约的尴尬局面 , 对于有效保障农产品质量安 全, 扩大对外出口贸易 ,保护生态环境具有十分重要的意义。 本研究主要取得以下 结果 :1. 通过富集驯化再分离法对人参种植地区多年被五氯硝基苯污染的土壤样 本进行分离 , 共获得 403 株降解细菌。采用透明圈法初筛获得 64 株能以五氯硝基

3、苯为唯一碳源生长的降解菌株。 采用紫外分光光度计法通过不同菌株对五氯硝基苯的降解率进行分析 , 最终获得 10株降解效果显著的菌株 ,当接种 7 d 时,菌株QTH3,CB8,DH19,JA30,BS34,HL37,SJH42,CB44,FS4和 CB56寸五氯硝基苯的降解 率分别为 88.89%、57.13%、90.86%、83.30%、86.68%、83.46%、84.36%、86.97%、 78.06%和 70.99%。2.通过形态特征、生理生化反应、分子鉴定及BIOLOG微生物自动鉴定系统对五氯硝基苯降解菌株 QTH3,CB8,DH19,JA30,BS34,HL37,SJH42,CB4

4、4,FS4和 CB56进行鉴定,鉴定菌株QTH3为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),CB8为短 小黄杆菌 (Brevibacterium sanguinis),DH19 为烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae),JA30 为红平红球菌 (Rhodococcus erythropolis),BS34 为烟草节杆 菌(Arthrobacter nicotianae),HL37 为短小橘杆菌(Brevibacterium antarcticum),SJH42 为赤红球菌 (Rhodococcus ruber),CB44 为施氏假单孢菌 (Pseudomon

5、as stutzeri),FS49 为红平红球菌 (Rhodococcus erythropolis),CB56 为大头茶菌属(Gordonia amicalis) 。3.采用 GC-MS/M测 定了五氯硝基苯在降解菌株 DH19作用下的降解动态,结果表明菌株DH19对五氯 硝基苯, 五氯苯胺及甲基五氯苯硫醚均有明显降解效果 , 接种 14 d 后对五氯硝基 苯的降解率为 98.64%,五氯苯胺和甲基五氯苯硫醚的残留量分别为未检出和 0.30 mg/kg 。4.为明确不同条件下降解菌株dh19对五氯硝基苯的降解特性，本研究在单 因素实验的基础上，采用响应曲面法对dh19的最适降解条件进行三因素

6、三水平 的响应面分析,得出最佳条件为温度30C,ph6.846和接种量1.45g/l。在最佳条 件下, 对菌株 dh19 的生长量和五氯硝基苯的降解曲线进行了研究。接种 7d 后, 五氯硝基苯的降解率在 90%以上, 且菌体生长量随着时间的延长 逐渐增加。由此表明，菌株dh19可以利用五氯硝基苯作为生长和降解的唯一碳源 和能量来源。5. 采用 gc-ms/ms 测定了菌株 dh19 对六六六、 ddt 、氯氰菊酯和氟氯氰菊酯 的降解,接种5d后，降解菌株dh19对六六六、ddt、氯氰菊酯和氟氯氰菊酯的降 解率均在80%以上,接种7d后，降解率均在95%以上，降解菌株dh19对六六六、ddt、

7、氯氰菊酯和氟氯氰菊酯均有较好降解效果。 6. 建立了五氯硝基苯降解酶促反应体 系,结果表明菌株dh19的降解作用以胞内降解酶的粗酶液为主，对五氯硝基苯的 降解率为 73.47%,而胞外蛋白粗酶液对五氯硝基苯的降解率仅为4.7%。对菌株dh19产酶培养基的优化,研究表明：菌株dh19产酶培养基的最佳碳源 及浓度为 8g/l 的葡萄糖,最佳氮源及浓度为 1.6g/l 的牛肉浸膏 ,种子液最佳的培 养时间为16h,发酵液培养的最佳时间为18h,发酵培养基初始ph为8,接种量为 2%时，降解菌株dh19的胞内降解酶的相对比活力最高，降解效果最佳。7.采用气 相色谱-串联质谱法检测五氯硝基苯在菌株 dh

8、19作用下的代谢过程中产生的离 子碎片, 与 nist 数据库进行比对分析 , 推断出 2,3,4,5,6- 五氯苯胺 ,3,5- 二氯苯 胺,3,4- 二氯苯胺, 苯胺和邻苯二酚这 5种可能的代谢产物。基于此,本研究推断了五氯硝基苯在菌株dh19的作用下的降解过程，推断了 一条从五氯硝基苯最终完全代谢成h2o和co2的降解代谢途径。8.通过对菌株dh19基因组中的部分基因进行pcr扩增，成功扩增到了铁硫簇中sufb,sufc,sufd 基因,并对 sufb 基因进行了克隆与分析 ,预测了该基因的启动子和终止子。此后,成功构建了 sufb基因缺失突变体厶sufb-dh19（kmr和gmr）和s

9、ufb互 补菌株 sufb-dh19（spr和smr）,并对dh19野生菌株、sufb基因缺失突变体厶 sufb-dh19（kmr和gmr）和sufb互补菌株 sufb-dh19（spr和smr）的降解效果进 行了比较。摇培7d后,野生菌株降解五氯硝基苯后的残留量为9.88mg/kg,降解率为89.71%,互补菌株 sufb-dh19降解五氯硝基苯的残留量为 25.77mg/kg，降 解率为73.16%,突变菌株厶sufb-dh19在7d后降解五氯硝基苯后的残留量为 34.75mg/kg, 降解率为 63.80%。因此, 铁硫簇中的 sufb 基因对 a.nicotianaedh19 降解五氯硝基苯具有一定 的正调控作用。9.通过利福平抗性标记对菌株 dh1 9的定殖动态进行研究 , 结果表 明菌株 dh19 在含有五氯硝基苯的土壤中可稳定定殖。通过