细胞传代冻存复苏步骤（干货分享）

1、细胞传代冻存复苏步骤准备工作:1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌300min,过后,关闭紫外灯,通风m。、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基开紫外时即将当天实验所用物品拿出，室温放置一段时间注意事项:1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。3、用完溶剂,培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。开始工作：、实验前换衣帽,开风淋，吹风。、7%乙醇擦手，然后用%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。5、取移液管一支，塞棉花端,及管身，均在酒精灯上烤一下，套

2、好吸球。6、用移液管加入适量的B缓冲液，缓慢荡洗一下细胞,然后将PS缓冲液弃掉。7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2l（所用胰酶的量)，弃掉枪头。、将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1in2i，目的：提高酶活性,促进消化。、取待用细胞，取移液管一支,塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。0、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞,将瓶底粘着的细胞吹散下来,再将细胞悬液移入的离心管中，封口,标签。1、离心5in,00转mi。以下分别介绍：一 换液1、取待用的细胞，旋紧瓶盖.2、弃去旧的培养液,把培养瓶放回原处。3、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下，套好吸

3、球。、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PB缓冲液弃掉。5、取移液管一支，塞棉花端,及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。7、将细胞置于O2、3度培养箱培养.二 传代1、细胞离心毕,拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液,吸取已配制的培养基适量，加入离心管中,将细胞重悬、吹匀。2、取46滴细胞悬液到新的培养瓶中,培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞，镜下观察，细胞密度适宜则置入5CO2、7度细胞培养箱中.三 冻存1、细胞离心毕，拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。2、按胎牛血清：DSO：的比例配制冻存液，装入青

4、霉素瓶中。3、用移液管将冻存液平均加入离心管中,混匀离心管中细胞冻存液。4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口，标签。、冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱1小时,然后放置2度冰箱2小时，再置于-8度冰箱过夜,最后置于液氮灌中保存。四 种板1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液。2、取培养瓶及小烧杯各一只，摆放好。、取移液管一支,塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。4、先移取2，5l,20l完全培养液，分别加入到离心管，培养瓶，小烧杯中。、混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取适量细胞悬液移入培养瓶,吹散细胞.镜下观察，细胞密度适宜则置入5CO2、

5、3度细胞培养箱中。(细胞传代目的）6、取细胞计数板,盖玻片酒精擦拭,均在酒精灯上烤一下，用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约l）,弃掉枪头，滴入盖玻片下(不能有气泡，不然会影响细胞计数），镜下观察细胞数(每个象限5个细胞,总和20个细胞，510个),不断调整小烧杯中细胞悬液的细胞浓度,直至镜下观察细胞数目符合要求。.感谢聆听.、取1个96孔板,用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周,孔板盖在酒精灯上烤一下.8、用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约100)，依次滴入96孔板中(枪头至孔下1/处），同时用移液枪吸取完全培养液（约100l)作为对照或调零，边缘孔用无菌PBS填充。9、滴完后,仍用酒精棉绕9孔板

6、边缘处擦拭一周.10、将96孔板置于5O2、37度细胞培养箱中进行培养。五 MT实验、接种细胞：用含1%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10001000个细胞接种到96孔板，每孔体积100。2、称取3g TT粉末，加m完全培养液,配制成浓度5的MTT溶液,0。22m的微孔滤膜除菌.3、培养细胞:同一般培养条件，培养5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。4、培养35天后，取出6孔板，用酒精棉绕孔板边缘处擦拭一周，孔板盖在酒精灯上烤一下.、用（120l）移液枪小心吸弃孔内培养上清液（包括调零孔内的培养上清液）,弃去枪头.再用移液枪按每孔10加TT溶液也包括调零孔，但边缘孔除外（枪头在孔

7、上3处）。6、呈色：继续孵育4小时,终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150l DS，置摇床上振荡10分钟,使结晶物充分融解。、比色:选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果,以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.六 复苏、准备工作：开启恒温水浴锅,将温度调节在37，取一离心管，加入ml细胞培养基。2、取出冻存管，立即放入水浴锅中快速摇晃，让冻存液迅速融化。、用酒精棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会.4、打开冻存管，将冻存液小心转移到预先加入有培养基的离心管中，800pm离心5分钟。5、小心弃掉上清，加入约5培养基重悬细胞.6、将所得细胞悬液转移入培养瓶中，盖上瓶塞，置培养箱培养。8 / 8文档交流换液,传代实验用材：牛奶瓶2个-BS缓冲液，DME培养基血清瓶1个-胰蛋白酶换液:移液管2个传代:培养瓶1个，移液管3个,离心管1个MTT