对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM一

1、对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用 mGM（一 ） 作者：田蓉，程绍辉，于继云，李巍，刘玉峰 【关键词】黑色素瘤 InhibitionoflungmetastasisofB16melanomacellstransfectedwithmurinegra nulocytemacrophagecolonystimulatingfactorinmice 【 Abstract 】 AIM:Toinvestigatetheinhibitionoflungmetastasisofmelanomabyatumorvacc ineofB16melanomacellstransfectedwithmurinegr

2、anulocytemacrophagecol onystimulatingfactor(mGMCSF).METHODS:ThemurinemelanomacelllineB1 6wastransfectedwiththerecombinantplasmidcontainingmGMCSF.Acelllines tablyexpressingmGMCSFwasobtainedbyG418selection.TheBalb/cmicewere administeredi.v.withB16cellstransfectedwithorwithoutmGMCSFrespectivel yandthel

3、ungmetastasiswasexamined2weekslater.RESULTS:Therecombinant celllineB16TRwasestablishedaftermGMCSFtranfectionandtheexpressionof mGMCSFwasconfirmedbyRTPCR.Thenumberoflungmetastaticlesionsofmice treatedwithB16TRwassignificantlyfewerthanthatofmicetreatedwithB16(n= 5,125.8 34.3vs27.8 24.0,P0.01).CONCLUSI

4、ON:ThemGMCSFtransfectionca nsignificantlysuppressthelungmetastasisofmelanomainmice.TheGMCSFcan beapromisingadjuvantintheimmunotherapyofmelanoma. 【 Keywords 】 melanoma;mice;granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor;lungneop lasms/secondary;cancervaccines 【摘要】目的：探讨小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( mGMCSF) 基因转导对 B16

5、 黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果 .方法：应用脂质体将 含有 mGMCSF基因的真核表达载体转染 B16 小鼠黑色素瘤细胞，经 G418加压筛选后，挑选表达 mGMCSF基因的 B16 黑色素瘤细胞 .观察 转导或未转导 mGMCSF基因的 B16黑色素瘤细胞在 Balb/c 小鼠体内的 肺转移.结果：转导 mGMCSF基因的 B16 黑色素瘤细胞可以稳定表达 mGMCSF，在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素 瘤细胞对照组，二者差异显著( n=5,125.8 34.3vs27.8 24.0,P)0.0结1 论：mGMCSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞 B16 的肺转移，提示

6、GMCSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景 . 【关键词】黑色素瘤；小鼠；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；肺肿 瘤/继发性；癌症疫苗 0 引言 黑色素瘤是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，早期即可发生肺、脑转移 . 其发病率有逐渐增高的趋势，然而目前尚无有效的治疗方法1-3 . 近年来，免疫治疗已经成为黑色素瘤治疗研究的一个热点 2,4-5，其 中，联合细胞因子的肿瘤细胞免疫是一个重要的方向，可以涉及几乎 全部与免疫系统相关的细胞因子 .GMCSF具有可增强粒细胞、巨噬细胞 活性，增强 MHC,MHC ,B7 分子的表达，增强抗原提呈功能等广泛 的生物学活性，因而可能在肿瘤的免疫治疗中具有着重要作用 .我

7、们拟 将 GMCSF基因转染黑色素瘤细胞系 B16，观察其对黑色素瘤细胞生长 及转移的影响，为抗黑素瘤免疫治疗进行有益的尝试 . 1 材料和方法 1.1 材料 B16 小鼠恶性黑色素瘤细胞系、含有鼠 GMCSF基因的真核表 达质粒 pGEMTeasymGMCS和F E.coliJM109为本室保存 .质粒提取试剂盒 购自博大泰克生物技术有限公司； RNA提取试剂盒、 RNA 逆转录试剂 盒均为美国 Promega公司产品；限制性内切酶、 AMV 逆转录酶、随机 引物均为宝生物公司产品；透析胎牛血清、 DMEM培养基、 G418,脂质 体转染试剂盒均为 Gibco公司产品； 68周龄雄性 Bal

8、b/c小鼠购自军 事医学科学院实验动物中心 . 1.2 方法根据 mGMCSF序列及 pcDNA3.1多克隆酶切位点设计引物，上 游:5 GCTAGCACCATGTAACTGCAGAATTT,A下C游3 5 CTCGAGCTCATT TTTGGACTGGTTTTT3. 引物由上海博亚生物工程有限公司合成. 以 pGEMTeasymGMCSF质粒为模板 ,上述 mGMCSF基因特异引物按常规方 法进行 PCR扩增.将 PCR反应产物进行 10g/L琼脂糖凝胶电泳分析 .通过 Nucleotrapkit(Clontech)回收阳性 PCR产物 .将回收的 mGMCSF基因及 pcDNA3.1分别用

9、以 NheI和 EcoRI双酶切,并用 T4DNA连接酶连接后， 转化 E.coliJM109获, 得重组质粒 pcDNA3.1/mGMCSF将. 限制内切酶进行 酶切鉴定正确的菌种送上海生工生物技术公司测定 DNA序列进行确证 . 采用 Lipofectin 试剂转染，按其说明书进行转染，同时转染 pcDNA3.1 空载体作为对照 .挑选阳性克隆进行扩大培养，加压筛选2mo 后进行 RTPCR鉴定细胞转染结果 .用 Promega 公司 RNA提取试剂盒提取、纯化 细胞总 RNA，进行总 RNA纯度分析后，按试剂盒说明进行反转录反应， 取反转录的 cDNA 链为模板进行 PCR反应.PCR扩增条件为： 95，预 变性 2min，继之以 32 个循环，包括 941min,521min,721min，最 后 72延伸 10min. 分别取 PCR产物进行 10g/L 琼脂糖电泳，紫外线投 射仪观察结果并照相 .胰酶消化体外培养的 B16细胞， PBS洗 3 遍，过 200目筛网得到单细胞悬液，调整细胞浓度为 5 109/，L 每只小鼠尾静 脉注射 0.2mL，2wk 后处死小鼠记数肺转移灶个数， 设立肿瘤对照组和 mGMCSF治疗组 .统计学处理：结果以 xs表示，各组结果数据应用 SPSS11.0统计软件进行 t 检验 . 2 结果 2.1pcDNA3.1/mGM