大型真菌DNA提取方法的改进-林业与环境科学

1、大型真菌 DNA 提取方法的改进广州 510520 ) 对提取高质量的 DNA 及随后的DNA 提取方法进行了改进，提出周玲玲 梁俊峰(中国林业科学研究院热带林业研究所，广东 摘要 : 大型真菌中的一些类群的子实体由于含胶质和多糖较多， 分子生物学实验有很大影响。针对这一现象，对过去大型真菌的一种实用、高效的 DNA 提取方法。通过实验证明，此方法去除样品中胶质和多糖的效果明显，可有效获得高质量的 DNA ，满足随后进行的分子生物学研究需要。 关键词： 大型真菌； DNA ；提取方法AN IMPROVED PROTOCOL FOR EXTRACTION OF DNA FROMMACROFUNG

2、I*Zhou ling-ling Liang jun-feng( Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangdong Province,Guangzhou510520, China )Abstract: Some macrofungi contain colloids and polysaccharides, which have a negative effect on extraction of high-quality DNA and subsequent molecular bi

3、ological experiments. In order to reduce the negative effect, a practical and efficient protocol for extraction of macrofungi DNA was developed. It showed that theprotocol could reduce colloids and polysaccharides of isolating DNA from the macrofungi effectively, which was beneficial for carrying ou

4、t the subsequent molecular biological studies.Key words: macrofungi; DNA; isolating methods大型真菌是真核生物界中一个重要类群， 了解大型真菌对研究整个真核生物界具有巨大影响和深 远意义。随着分子生物技术的发展和对大型真菌研究的深入，从分子水平上对其基因资源、遗传基础 及系统分类进行研究逐渐成为大型真菌研究的一个重要方面。获取高质量的总 DNA 是进行分子生物学研究的前提和基础，不少学者对不同类群真菌的DNA 提取方法进行过研究，如丝状真菌、白腐真菌等1 4。由于一些大型真菌子实体盖表胶质化，富含多糖27

5、，用已往常用方法提取这类真菌干标本的DNA ，普遍存在胶状物质及多糖去除不彻底的缺陷，导致提取的 DNA 质量不高， 进而在很大程度上影响了大型真菌分子生物学研究的后续工作。为了能够有效地获得高质量的 DNA ，笔者通过提取若干富含胶质或多糖的大型真菌干标本牛肝菌类(Boletoid )和红菇属( Russula)的DNA ，对提取方法进行了改进，旨在获得一种较佳的并能够高效、高质地提 取这类真菌的 DNA 的提取方法，为该类真菌的分子生物学研究提供参考。1 材料与方法1.1 材料实验采用 8种真菌材料，在野外收集新鲜实验材料，即时用硅胶干燥，将分子材料带回实验室进 行DNA 提取，具体菌株及

6、其来源见表 1。基金项目：国家自然科学基金资助项目( NO.31070014 )和中国林业科学研究院热带林业研究所基本科研业务费专 项资助项目( RITFKYYW2010-10 )。作者简介：周玲玲( 1983)，女，硕士，主要从事森林保护研究。* 通讯作者，梁俊峰， E-mail; jfliang2000 。表 1 供试菌株及其来源编号种名来源1红色红菇( Russula rosea )广西省苍梧县木桑镇2葡酒红菇( R. vinosa )云南省景洪市大渡岗镇3致密红菇( R. compacta )云南省景东县哀牢山自然保护区4红菇( R.lepida )云南省景东县哀牢山自然保护区5兄弟牛

7、肝菌( Boletus fraternus )海南省昌江县霸王岭自然保护区6黄粘牛肝菌( Suillus flavidus )云南省丽江市象山7黄粉牛肝菌( Pulveroboletus ravenelii )海南省乐东县尖峰岭自然保护区8大津粉孢牛肝菌( Tylopilus otsuensis )海南省乐东县尖峰岭自然保护区1.2 DNA 提取1.2.1 常规的 CTAB 法有关大型真菌的 DNA提取方法甚少报道，仅 Xu等研究过大型真菌 DNA 的提取 4 ，本文将其方法 作为常规的 CTAB 法，具体的提取步骤参见该论文。1.2.2 改进的二次 CTAB 法(1) 取2050 mg干净材

8、料置于已灭菌的 1.5 mL 离心管中，离心管中预先加入少许石英砂和PVP。(2) 用镊子夹住盛有材料的离心管管缘，将离心管浸入液氮中，冷却数秒取出后，迅速用塑料研 磨杵研磨材料，使之呈细粉状。冷却时注意要将离心管管口高于液氮表面，以防污染。(3) 在装有磨碎材料的离心管中，加入 700 L 在65水浴预热的 4CTAB裂解液 1L溶液中， 1M Tris-HCl (pH = 8.0) 100 mL, NaCl 82 g, 0.5M EDTA (pH = 8.0) 40 mL ，CTAB 40 g ，PVP 2 g ，充分混匀， 65水浴约 0.5 h ，水浴过程中每隔 10 min 摇匀一次

9、 。使用裂解液前在其中加入 0.4%裂解液体积的 - 巯基异醇，充分混匀。(4) 将水浴的离心管取出置于室温下， 待冷却至室温后加入等体积的氯仿 -异戊醇 (体积比为 24:1) 摇匀 35 min， 12 000 rpm 室温离心 10 min。(5) 弃上清和下液， 保留中间固相层， 重新加入 700 L预热的 4CTAB裂解液， 充分混匀， 65水 浴约 1.5 h，水浴过程中每隔 10 min 摇匀一次。(6) 1.5 h 后，取出离心管，获得的上清加入等体积的(-20)异丙醇沉降 DNA ，充分混匀后，于-20条件下过夜保存。(7) 将冷冻保存的离心管取出置于室温下，待温度至室温时，

10、 12 000 rpm 室温离心 10 min。(8) 弃上清，注意保留离心管底部的沉淀即DNA ，用 400 L的 70%的乙醇和无水乙醇各冲洗DNA 12 次，每次均以 12 000 rpm 室温离心 2 min 后弃上清。(9) 将离心管置于通风橱中或自然风干，使乙醇充分挥发。(10) DNA 充分干燥后加入 30 L 的1TE缓冲液 10mM Tris-HCl ，1mM EDTA( pH = 8.0) 或灭菌超 纯水，加 2 L RNase，于37恒温箱中消化 RNA 30 min 后置于 - 20冰箱保存备用。1.3 DNA 电泳检测以15000bp DNA Ladder为标准，将上

11、述提得的 DNA 取3.0 L 与0.5 L 溴酚蓝( 40%蔗糖， 0.25% 溴酚蓝)混匀，在含 5 Goldview 核酸染料的 1% 琼脂糖凝胶于 1.0 TAE缓冲液中电泳 , 电泳电压 120 v，当溴酚蓝远离点样孔到一定距离时(约离点样孔2 3处)，停止电泳，将凝胶取出后在凝胶成像系统估测所得 DNA 的分子量，记录并保存结果。1.4 PCR 扩增反应1.4.1 PCR 扩增反应体系PCR扩增反应体系选用 25 L反应体系，其中包括 10扩增缓冲液含 (MgCl 2) 2.5 L，200 M dNTP2.5 L，5 M的引物各 1 L ，Taq DNA 聚合酶 0.5 l(2.5

12、 U/ L)，DNA 模板0.5 L，用ddH 2O定溶至 25 L 。Taq DNA 聚合酶由天根生化科技有限公司生产；扩增片段选用内转录间隔区序列 （ITS） ，该片 段目前广泛应用于大型真菌的种的鉴定，该片段成对引物ITS1和 ITS48由上海生物工程技术服务有限公司合成。1.4.2 PCR 扩增反应程序PCR扩增反应程序的热循环参数： 94变性 5 min ；然后连续 35个循环： 94变性 30s，50退火 30s，72延伸 2 min ；循环结束后 72再延伸 5 min ，最后 4保存。扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳 检测（方法同 DNA 电泳）。2 研究结果与分析2.1 DN

13、A 提取结果对牛肝菌类和红菇属的八个种进行 DNA 提取，每份标本提取 2 份 DNA ，分别标记为 1a 8a 和1b8b，a对应于一次 CTAB 提取的 DNA ，b对应于二次 CTAB提取的 DNA ，研究结果见图 1。从图1可以看出， 1a8a样品所含 DNA 浓度较高，但同时由于所含胶质等杂质较多，DNA 不能形成明显条带， 残留在胶孔中较多； 1b8b样品所含 DNA 浓度较 1a 8a样品的低， 但所含杂质明显减少， 电泳图谱基本形成明显的 DNA 条带。图 1 两种方法提取的 DNA 电泳图2.2 PCR 扩增结果图 2 是用扩增内转录间隔区序列 （ITS）的成对引物 ITS1

14、 和 ITS4 扩增上述实验提取的 DNA 。扩 增反应为 25 L 反应体系，取 3L 于 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图可见，在相同的扩增反应 程序和相同的扩增反应体系下， 1b8b DNA 均能扩增出清晰可辨的 ITS 条带，且条带亮度较高； 而 1a、3a 5a、 7a、8a DNA 扩增出的条带亮度相对较低， 2a和 6a DNA 未能检测到扩增产物。 图 2 两种方法提得的 DNA 的 PCR 产物电泳图3 讨论3.1 大型真菌的细胞壁主要由几丁质和纤维素组成，以几丁质为主，几丁质具有保护作用，使得 细胞壁坚实，不易裂解 9 ，因此在研磨过程中，需要把样品磨至细粉状，否则会影响D

15、NA 产量及质量；但研磨时间不宜过长，样品会因长时间研磨而发生褐变反应，最终也会影响 DNA 产量及质量，所 以，操作时应尽量在最短时间内迅速把样品研磨成细粉状，以便提高 DNA 产量和质量。3.2 有关介绍真菌尤其是大型真菌 DNA 提取方法的文献不多 1-4, 9，由于一些类群的大型真菌中富 含多糖、胶质等物质，这无疑给其 DNA 的提取带来一定难度。多糖类物质易形成粘稠的胶状物，给 DNA 的分离带来困难，从而影响后续实验特别是PCR扩增。在提取 DNA 过程中，一次 CTAB 法提取的DNA 往往色素含量较多，且在去除多糖、胶质等物质方面效果也不够理想；提取DNA 时，用氯仿 -异戊醇

16、抽提后，上清和中间固相层含有较多胶质与多糖，实验操作中不易吸取上清，吸取的上清液常含 有上述物质， 导致提取的 DNA纯度不高， 这在一定程度上影响了后续的 PCR扩增，进而影响下游操作； 二次 CTAB 法是对一次 CTAB 法的改进，即在提取过一次 DNA 的基础上继续提取。由于在第一次提取 DNA 的过程中已经去除大部分胶质、多糖及色素，因而第二次提取的DNA（1b 8b）较第一次提取的DNA（1a 8a）所含的胶质、多糖及色素明显减少。虽然二次CTAB法获取的 DNA 浓度较第一次获取的稍低，但质量更高、更纯，有利于进行 PCR扩增，为后续实验提供了有效保障。3.3 实验对提取的 DN

17、A进行PCR扩增ITS区段。扩增结果表明， 1a8a DNA 扩增的效果较差，条 带亮度不高，表明扩增产物产量较低；且用一次CTAB提取的 2a和6a样品电泳检测时未能检测出扩增产物条带，原因可能是由于提取的 DNA 中含较多胶质，影响了 PCR扩增反应，导致未能扩增出扩增产 物或扩增产物浓度太低难以检测出来；当然也不排除实验中的操作误差，为了减少操作误差，我们对 上述样品重新进行扩增并电泳检测，结果与第一次基本相同。但在相同条件下，1b8b DNA 均能扩增出清晰可辨的 ITS条带，条带亮度较高，效果较好，并且从图中也可以看出模板DNA 的少量降解对PCR扩增结果几乎没有影响。因此二次 CT

18、AB 法提取的 DNA 较一次 CTAB 法提得的 DNA 更有利于 PCR 扩增。3.4 综上分析，二次 CTAB 法是提取富含胶质或多糖等物质的大型真菌总 DNA 较为理想的方法。 用该法提取的总 DNA 能满足分子生物学研究的要求。参考文献1 马丽华,谢冰,黄民生. 白腐真菌的 DNA提取和RAPD研究初探 A . 微生物生态学研究进展第五届微生物生态学 术研讨会论文集 ,2003,1013.2 何月秋 . 真菌菌丝体培养和提取 DNA方法的改进 J . 菌物系统 ,2000,19(3) : 434.3 韩利刚,袁毅,王罡. 丝状真菌组织 DNA的提取J . 生物技术 ,1999,9(6) : 3841.4 Xu J, Yoell HJ, Anderson JB. An efficient pro