(完整word版)重组质粒的构建转化筛选和鉴定0001

1、 山东大学实验报告2012年11 月26 日 科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一 姓名 系年级 学号 第6页共5页 分子生物学实验报告 一、实验目的 1 学习在实现 DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性 核酸内切酶对载体和目的 DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2. 学习设计构建重组 DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA1接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。 5. 学习

2、掌握热击法转化 E.coli的原理和方法。 6. 掌握a互补筛选法和 PCR佥测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大 小。 二、实验原理 外源DNA与载体分子的连接即为 DNA重组技术，这样重新组合的 DNA分子叫做重组子。重 组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有 Mg2+ ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制 性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后 的细胞在选择性培养基中培养，可以通过a互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行 重组子的鉴定。 1. 重组子的构建 酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶

3、不能目的基因内部有专一的 识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。 其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和 单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的 片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组 子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目 的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易 行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件

4、，最主要的因素是反应 温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低 温后高温”的原则进行反应。 (要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模 也取决于需要酶切的 DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不 能超过反应总体积的 10%因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶 切反应体系中甘油的含量超过5%就会抑制酶的活性。) 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技 术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双

5、链 DNA片段相邻 的5-磷酸和3 -OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体 的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔 数之比控制在1: (13)之间，可以有效地解决 DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用 速率和末端结合速率之间，一般是16C，用常用的连接时间为 12-16h。 2. 感受态细胞的制备及质粒转化 构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必 须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌 的遗传特性，同时与菌龄、外界环

6、境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有 姓名 系年级 学号 摄取DNA勺能力，或人为地将 DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击 法，电穿孔法等。能否实现质粒 DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一 般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCI2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15% 的无菌甘油，-70 C可保存半年至一年。经过CaCI2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源 DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿 孔技术，使载

7、体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出 现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以 E.coli DH 5 a菌株为受体细胞，用 CaCI2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质 粒在42 C下热击90s，实现转化。 3. 重组子的筛选鉴定 重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数 重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好 增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体 细胞中，除部分含有

8、我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载 体与多个外源DNA片段形成非期待重组 DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段 区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用 的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR佥测方法。 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体 菌则不能存活，a互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PUC19携带有 氨苄青霉素抗性基因(Ampr),在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的 受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒

9、PUC19进入E.coli DH 5 a后，通过a - 互补作用，形成完整的 3-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用3-半乳糖苷酶分 解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质 粒的E.coli DH5 a，没有3 -半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利 用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白 色菌落。重组后的载体 DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成a -互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基 上形成白色菌

10、落。 挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情 况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后 发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取 出来，进行后续的酶切、电泳检验。 三、实验仪器和材料试剂 菌株：E.coli DH 5 a 培养基： LB培 养基、 麦康凯培 养基 (加入AP) 仪器：高速离心机，恒温震荡培养箱，恒温水浴锅，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽， 梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendof管，微量移液器，计时器 试剂:TAE电泳缓冲液(10 X

11、 )，琼脂糖,溴化乙锭(EB),入DNA7 Hind川Marker ,DL2000plus DNA PUC19质粒，酶切 10X buffer , Hi nd川,重蒸水 姓名 系年级 学号 四、实验步骤 1.载体与外源片段的酶切 pUC19（自提） ADNA(comm) pUC19(comm) ddH20 13.5-12.5 66.0 37.5 10 x/(1 buffer 2.0 10.0 5.0 DNA 3.0-4.0 15.0 5.0 Hi ndlll 1.5 9.0 2.5 Total 20.0 100 50.0 混合均匀，上下摇晃4000转1min 均分为两管，37 C水浴2hrs

12、1h后，取一管，1%琼脂糖 凝胶电泳，100v电压40min 2.载体与外源片段的链接 Comp Vol (1 l) 1 ddH2O 3.2 2 10 xT4 连接酶 Buffer 1.0 3 pUc19川1 1.5-2.0 4 入 /III 3.5-3.0 5 T4 DNA连接酶 0.8 Total 10.0 混合均匀，上下摇晃4000转1min 16C保存 3. 感受态细胞的制备与转化 E.COli DH5 a感受态细胞的制备 甘油管t LB平板（活化）7单菌落t LB平板（37 C o/n 20mlLB（37 C o/n）宀1%专接至新 鲜 LB液t 37 C 2-2.5hrs t冰浴

13、10mint 1.5mlx2 , 4000rpm/6000rpm 5min t Votex+800ml CaCI 2 吹吸悬浮细胞t 4000rpm 5min吸弃上清t 100卩l 0.1M CaCL,轻悬，冰浴 20mint感受态细胞 4. 质粒的转化及重组质粒的筛选 分组步骤 c.c DNA 冰浴 热激 冰浴 复苏 培养 基 涂布平板 ligati on 麦+AP 50 i lx1 I-test 100 5.0 5min 42 C 5min LB 100 1 lx2 -10min 90s 900 150 1 lx2 1 l/tube 200 1 lx 2 II-tra nf 50 pUc1

14、9 37 C 1h 麦+AP 50 1 lx1 Con trol 0.5 III-c.c 50 麦+AP 50 1 lx1 Co ntrol 麦 50 1 lx1 预留一个麦+AP平板 静置10min，于37 C倒置培养16-20hrs 5.重组质粒的提取及电泳检测鉴定 I中的平板t白色单菌落（无菌牙签）T接入预留麦+AP平板T 4-6个菌落/组T37C倒置 o/n 系年级 学号 五、实验结果 pUC19和入DNA经Hi nd III 单酶切作用结果的电泳检测 入 DNA、nT(en-) 典DNA puclg/m pucig 电泳结果表明： 入DNA分子量2万3bp pUC19商业和测试酶切完

15、全，分子量在2300+,经查的2686bp 19组提质粒结果均出现两条亮带， 上面的是酶切切开的质粒， 下面的为超螺旋结构， 最下方模 糊条带为RNA少量残留，表明 RNA酶效果显著，但仍没完全除掉 RNA （通过对照组未加 RNA酶 很明显能看出） 两条亮带上方混杂带可能是DNA染色体的残留 在质粒转化与重组质粒筛选的过程中， 第一次加于麦康凯培养基的 AP （氨苄青霉素）效果失活， 导致II号平板即生长白菌又生长红菌，筛选失败。后老师又重新做了一批加入新AP的实验证 明ap抗生素失活。 E.Z.N.A. TMPlasmid Miniprep Kit试剂盒提取重组质粒的电泳检测 姓名 系年级

16、 学号 UL7 口口OP-U5 pug 电泳结果表明： 所有组质粒中均连接上了或大或小的片段（125bp, 700左右bp, 6000+bp）而且并没有出现一 个泳道有多个条带的混杂情况，证明单菌落挑的成功，且提质粒时没有混杂。 我组连接片段为125bp和6000+bp 六、注意事项 1. 实验之前枪尖，PE管，移液器，牙签都应包好灭菌 2. 无论手提还是试剂盒提取质粒，应按顺序加入试剂，solution II和III时不要间断，溶液 在pe管中混合式应轻摇 3. 加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和 DNA最后加酶。且要把样品加到液面下， 酶从-20 C冰箱中拿出后放在冰中待用，加酶时枪尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓 慢吹吸几次，保证足够的酶量 4. 无菌操作时不能带一次