实验7_植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

1、植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测(2010级生态班实验方案)一、实验目的1. 理解用CTAB法提取植物组织DNA的原理。2. 掌握CTAB法提取植物组织DNA的方法。3. 了解真核基因组DNA的有关特性。二、实验原理由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一般的提取 真核细胞基因组DNA的方法用在植物细胞上并不十分有效。十六烷基三乙基 溴化铵(cetyltriethy lam mon ium bromide, CTAB)法是常用的提取植物细胞基因 组DNA的方法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合 物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)时，CTA

2、B-核酸复合物是可溶的，当降低 溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl )时，从溶液中沉淀，通过离心就可将 CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70- 75% 酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、 色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等 DNA沉淀剂将DNA沉淀分离 出来。植物DNA的提取程序应包括以下几项：必须破碎或消化细胞壁释放出 细胞内容物；必须破坏细胞膜及核膜，使DNA释放到提取缓冲液中，常用CTAB 一类的去污剂使细胞膜崩解；DNA粗提物中往往含有大量 RNA、蛋 白质、多糖等杂质，可利用氯仿、R

3、Nase等除去。一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。CTAB法提取植物DNA，方法比较简单，适用 于大多数植物。虽然得到的 DNA纯度不是很高，但仍能满足限制性内切核酸 酶分析或PCR扩增的要求。三、实验材料、试剂和仪器1. 材料新鲜的植物组织(如幼叶、花器、幼根)或-80 C冻存的材料。仪器、用具：离心机、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水 浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH计、高压灭菌锅、一次性手套、电泳 仪、电泳槽等。2. 试剂(1)2 x CTAB 缓冲液：CTAB(W/V)2%Tris-HCI pH 8.0100 mmol/LEDTA pH 8.020mmol/

4、LNaCI1.4 mol/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮)1%(2)TE 缓冲液(pH 8.0):称取 1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2,先用 800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0,再用蒸馏水定容至1000 mL。 咼压火菌20 min。(3)氯仿/异戊醇（24:1,v/v）:将氯仿和异戊醇按体积 置棕色瓶中，4C保存。24:1的比例混匀，(4)伶巯基乙醇(5)70%乙醇(6)乙醇或异丙醇(7)5XTBE电泳缓冲液（1L）:Tris54gNa2EDTA 2H2O3.72g硼酸27.5g临用前稀释至0.5 XBE电泳缓冲液(8)6Xh样缓冲液：0.25%溴酚兰

5、、40%蔗糖四、实验步骤（一）植物DNA提取1.在5 mL离心管中，加入1000卩的2CTAB, 65 C预热。用前加入 20卩们巯 基乙醇。2.取嫩的组织材料0.5-1 g,放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状， 用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，充分混匀后置65C水浴中保温45-60min,并不时轻轻转动试管。3. 加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下 10 000rpm离心10 min, 移上清至另一 5 ml新管中。4. 吸上清到新管中（5mL离心管），用氯仿/异戊醇重复抽提一次。5. 加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20

6、C放 置 30 min 或-80C放置 10min，12 000rpm离心 10-15min 回收 DNA 沉淀。6 弃上清，用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于适量的灭菌 ddH2O或TE缓 冲液中。7.用紫外分光光度计在260 nm、280 nm波长分别读数。其中260 nm读数用来 估计样品中DNA的浓度，OD260/OD280的值用于估计DNA的纯度。1个OD260 值相当于50卩g/m双链DNA。样品浓度(卩g/ml)=OD60 x稀释倍数x 50对于 DNA 纯制品，其 OD260/OD280 1.8 OD260/OD2801.8 说明有 RNA 污染； OD260/OD2801.

7、8说明有蛋白质污染。注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作 DNA溶液和 快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要，不能振荡，不能使用太细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植 物DNA抽提中的主要污染物，提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试材较老、 多糖含量高，在提取缓冲液中应提高？-巯基乙醇的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚：氯仿:异戊醇抽提一遍，这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色，若呈褐色则有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液中 CTAB的浓度可增至3%或更高。(二)琼脂糖电泳检测 DNA制作0.8%的琼脂糖

8、凝胶，吸取提取的DNA溶液10卩L+ 4卩上样缓冲液， 电泳检测。用入DNA做分子量大小的Marker,如果带型不弥散，在与Marker 20 kb的带的相应位置出现整齐明亮的条带，说明 DNA完整，没有降解。(1 )制胶槽水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与制胶槽之间留1mm空间。(2 )称取DNA电泳用琼脂糖0.4g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml 0.5 :TBE缓冲液，混匀后，将烧瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全 溶解(每块胶用20 ml左右融化的0.8%的琼脂糖凝胶，每两组配50ml 0.8%的琼脂糖凝胶)。(3) 取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至 60C左右(手握烧瓶可

9、以耐受)， 即将凝胶溶液倒入制胶槽中。(4) 室温下待凝胶完全凝固，需时约 30分钟，拔出梳齿，将胶板放入 电泳 槽中。(5) 在电泳槽中加入0.5 XBE缓冲液，以高出凝胶表面 2mm为宜。(6) 取一 PE手套(用PE手套混合样品和上样混合液，样品总体积不宜超过15yL，如下表所示准备电泳样品，用移液器混匀。序号1234样品1入 DNA/HincKDNA溶液DNA溶液DNA溶液体积5 L58106 X上样缓冲液2 L2 L3 L4 L(7)用加样器吸取样品。依次分别加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置 于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。(8)接通电源，调节电压至80伏，

10、电泳直至溴酚蓝指示剂距胶底 1cm处, 将凝胶板取出，用凝胶成像系统成像或者在紫外灯下观察结果，拍照。-点的痕迹，山风呼呼，细雨微微。人行翦翦，心韵盈盈。思邃恒古，本义使 然，让思想的光芒照亮每个心灵，让身心的热量变作普照大地的明媚，让 蠕风的蠢蠢欲动万木复苏的定格。在这片神圣的土地上，色彩是洁净的象征，静物是可修复的抱朴，人 境是可绝缘的尘，合沓车马也无喧。吾生有无涯而也无涯，知也以有而随 无也，有有也者，有无也者，有未始有无也者，有未始有夫未始有无也者俄而有无矣，而未知有无之果孰有孰无也。今我则已有谓矣，而未知 吾所谓之其果有谓乎，其果无谓乎 ？摘自于庄子 齐物论。多一事不如少一事，少一事不如没一事，没一事不如了一事，了一事 不如空无一事。人之所以不幵心，那是因为想要的太多，人之所以不顺心, 是因为付出太少，之所以不如意，也是因为，总计较那些得与失。一念起千山万水，一念灭沧海桑田。念人念心念天念地，随心律动，心随所动，虽有嘉肴，弗食不知其旨也；虽有至道，弗学不知其善也。是故 学然后知不足，教然后知困。知不足，然后能自反也 ；知困，然后自强也。 故曰：教学相长也。她也惟有付之一叹，青年的容貌，盛气，都渐渐地消磨去了。她怕见旧时的挚友。她改变了的容貌，气