原核生物分子克隆的宿主和载体系统

1、第二章第二章 原核生物分子克隆的原核生物分子克隆的 宿主和载体系统宿主和载体系统 本章节主要内容 用于用于DNADNA复制的特殊大肠杆菌品系复制的特殊大肠杆菌品系 DNADNA克隆载体克隆载体 细菌细菌DNADNA转化方法转化方法 基因克隆的噬菌体系统基因克隆的噬菌体系统 2 第一节 应用广泛的细菌宿主 一、一、E. coliE. coli K12 K12 的生物学的生物学 革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌 没有核膜和染色体没有核膜和染色体 一个环状双链一个环状双链DNADNA分子，有一个复制起点分子，有一个复制起点 细胞中能维持细胞中能维持质粒质粒DNADNA的复制的复制 生活周期较短，生活周期

2、较短，20min20min分裂一次分裂一次 能在发酵罐中高密度生长能在发酵罐中高密度生长 能在平板上培养出单克隆能在平板上培养出单克隆 3 A) A) laclac operon operon结构以及表达特性结构以及表达特性 二、乳糖操纵子乳糖操纵子 lac Zlac Z: -gallactosidase (-: -gallactosidase (-半乳半乳 糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖） lac Ylac Y: lactose permease: lactose permease（半乳糖苷（半乳糖苷 透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁透性酶，运送乳糖透

3、过细菌的细胞壁) ) lac Alac A: transacetylase: transacetylase（半乳糖苷乙（半乳糖苷乙 酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收 的有毒的硫代半乳糖苷的有毒的硫代半乳糖苷 thiogalactoside)thiogalactoside) lac Ilac I: : 乳糖阻遏蛋白基因乳糖阻遏蛋白基因 P Plac lac : :乳糖代谢结构基因的启动子 乳糖代谢结构基因的启动子 P PI I : : 阻遏蛋白基因的启动子阻遏蛋白基因的启动子 CAPCAP：代谢激活蛋白结合位点：代谢激活蛋白结合位点 4 阻遏蛋白四聚体不仅能被

4、别乳糖结合，也能被与别乳阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳 糖结构类似的物质如糖结构类似的物质如IPTG(IPTG(异丙基异丙基- -D-D-硫代半乳糖）结硫代半乳糖）结 合，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解合，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解 的分子，称为的分子，称为安慰性诱导物安慰性诱导物 5 二、乳糖操纵子二、乳糖操纵子 利用利用-半乳糖苷酶及其基因半乳糖苷酶及其基因 -半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-galX-gal形成形成 蓝色物质，可用此反应来检测细胞中蓝色物质，可用此反应来检测细胞中-半乳半乳 糖苷酶的活性。糖苷

5、酶的活性。 6 a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选） lacZ - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶- 分解半乳糖分解半乳糖 iPO 调控蛋白调控蛋白 -肽段肽段 分解分解X- gal 产物呈现蓝色产物呈现蓝色 诱导剂诱导剂 IPTG -半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M15 7 a-a-互补显色反应（蓝白斑筛选）总结互补显色反应（蓝白斑筛选）总结 细菌菌株细菌菌株野生野生 型型 突变体突变体 （Lac ZLac Z- -基基 因）因） 突变体突变体+ +无外源片段无外源片段 插入质粒插入质粒 （ Lac ZLac Z- -+ Lac + Lac ZZ） 突变体突变体

6、+ +有有 外源片段插外源片段插 入质粒入质粒 （ Lac ZLac Z- -） Lac Z Lac Z 蛋蛋 白白 有有无（仅有无（仅有 片段）片段） 有（有（+ +片段）片段）无（仅有无（仅有 片段）片段） 底物底物X-galX-gal 分解情况分解情况 蓝色蓝色 菌落菌落 白色菌落白色菌落蓝色菌落蓝色菌落白色菌落白色菌落 抗生素抗性抗生素抗性无无无无有有有有 8 第二节第二节 质粒载体质粒载体 一、质粒的基本生物学特征一、质粒的基本生物学特征 质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价 闭环，双链闭环，双链DNADNA分子。分子。 大都数质粒具有

7、大都数质粒具有复制原点复制原点，能独立进行复制，不，能独立进行复制，不 依赖寄主的细胞复制周期。依赖寄主的细胞复制周期。 质粒质粒 9 质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗 性等。性等。 选择性标记选择性标记(selectable marker):(selectable marker):由于质粒携由于质粒携 带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些 标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒 与隐性质粒与隐性质粒. . 第二节第二节 质粒载体质粒载体 10 二、质粒的大小和

8、拷贝数二、质粒的大小和拷贝数 相对分子量从相对分子量从 1kb1kb到到250kb250kb不等。分子量较小不等。分子量较小 的适合实验室利用的适合实验室利用 拷贝数拷贝数 严谨型严谨型: :少数拷贝存在于细胞中（少数拷贝存在于细胞中（1-1-几个）几个） 松弛型松弛型: :多个拷贝存在于细胞中（多个拷贝存在于细胞中（1010） 严谨型与松弛型是严谨型与松弛型是相对相对的。的。 第二节第二节 质粒载体质粒载体 11 （1 1）、反义）、反义RNARNA进行调控的机制进行调控的机制 （plasmid Col E1 plasmid Col E1 ） Ropdimer PRNAII RNA II A

9、 A、在复制起点处，、在复制起点处， RNA IIRNA II（长（长555555个碱基）与质粒个碱基）与质粒DNADNA形成形成 RNA-DNARNA-DNA复合物，复合物，RNARNA酶酶H H的降解的降解RNA II RNA II ，露出，露出33自由羟基，自由羟基， 质粒复制起始。质粒复制起始。 三、调节拷贝数的机理三、调节拷贝数的机理( (质粒的复制，补充知识质粒的复制，补充知识) ) 12 B B、 如果如果RNA IRNA I和和RNA IIRNA II形成双链形成双链RNARNA螺旋，螺旋，RNARNA酶酶H H不能不能 降解降解RNA IIRNA II，复制不能进行。，复制不

10、能进行。 Ropdimer PRNAII RNA II 13 C C、 当质粒的浓度比较高当质粒的浓度比较高 的时，的时，RNA IRNA I和和RNA IIRNA II 形成双链形成双链RNARNA螺旋，使螺旋，使 质粒的复制不能起始。质粒的复制不能起始。 D D 、 当质粒的比较低时，当质粒的比较低时， RNA IIRNA II与质粒与质粒DNADNA形成形成 RNA-DNARNA-DNA复合物，复合物，RNARNA酶酶 H H降解降解RNA II RNA II 质粒复制质粒复制 起始。起始。 E E、突变、突变RNA IRNA I或去除或去除RopRop 基因导致质粒的拷贝数基因导致质粒

11、的拷贝数 增加。增加。 14 (2 )(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 （ pS101pS101质粒）质粒） A A 复制原点区域含有复制原点区域含有3 37 7拷贝的长度为拷贝的长度为171722bp22bp的的 重复区域，重复区域，R1R1、R2R2、R3R3等。等。 15 (2)(2)关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 B B、复制原点附近有一个编码基因、复制原点附近有一个编码基因repA,repA,编码编码RepARepA蛋蛋 白。白。 RepARepA是双功能的蛋白：是双功能的蛋白： 与复制原点区域

12、的重复序列结合，起始与复制原点区域的重复序列结合，起始DNADNA的的 合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。 16 质粒拷贝数由质粒拷贝数由RepARepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调 节。节。 如果质粒拷贝数高，如果质粒拷贝数高， RepARepA蛋白与自身的启动子区蛋白与自身的启动子区 域结合，抑制转录，域结合，抑制转录，RepARepA蛋白合成受阻，蛋白合成受阻，DNADNA的复的复 制受到抑制。制受到抑制。 RepARepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它

13、们连 接起来，避免复制起始。接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和细胞分裂后，拷贝数和RepARepA蛋白的浓度降低，蛋白的浓度降低， RepARepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNADNA 的合成的合成 。 (2 )(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 17 问题：问题：在寄主复制后，质粒是如何分在寄主复制后，质粒是如何分 配到子细胞中？配到子细胞中？ ParPar原件会附着在细胞膜上，随着细胞的原件会附着在细胞膜上，随着细胞的 分裂，质粒正确分裂，质粒正确 分配到子细胞中，维持相对分配到子细胞中

14、，维持相对 稳定的质粒拷贝数。稳定的质粒拷贝数。 18 第二节第二节 质粒载体质粒载体 四、相容性四、相容性 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切 的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定 地共存的现象，称为地共存的现象，称为质粒的不相容性质粒的不相容性，或称为，或称为 不亲和性（不亲和性（Plasmid incom- patibility)Plasmid incom- patibility)。这。这 样的两种质粒称为不亲和质粒样的两种质粒称为不亲和质粒 19 第二节第二节 质粒载体质粒载体 引起质粒的不相容的

15、机理引起质粒的不相容的机理 A A 具有相同的复制调控机制具有相同的复制调控机制 B B 控制质粒分配的控制质粒分配的parpar元件相同元件相同, ,也会引起质也会引起质 粒的不相容粒的不相容 不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一 个群体，一般具有相同的复制子个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1ColE1/pMB1 20 五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体 克隆载体：是一种能携带外源克隆载体：是一种能携带外源DNADNA片段进入受体片段进入受体 细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的细胞，并在受体细胞中得到维持或表达

16、的DNADNA分分 子。子。 通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改 造而成。造而成。 1 1 质粒克隆载体的命名法质粒克隆载体的命名法 pBR322pBR322 “p” “p” 代表质粒代表质粒 “BR”BR”代表构建的实验室代表构建的实验室 “322”322”区别于其他的质粒区别于其他的质粒 21 五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体 2 2、质粒载体的一般特性、质粒载体的一般特性 （1 1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。 （2 2）具有选择标记基因）具有选择标记基因 （3 3）具有若

17、干限制酶单一位点）具有若干限制酶单一位点 （4 4）具有较小的分子量和较高的拷贝数）具有较小的分子量和较高的拷贝数 22 R7268 ApR R1 drd 19 ApR CmR SmR SuR KmR pMB3 ApR pSF2124 ApR pBR312 ApR TcR pSC101 TcR 1 2 pM88 pMB9 TcR 3 4 ColE1 5 6 6 pBR313 ApRTcR pBR322 ApR TcR 7 8 pMB1 (b) 五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体 3 3、第一个人工构建的遗传载体、第一个人工构建的遗传载体 23 4 4、改进了的载体（、改进了的

18、载体（pUCpUC载体载体乳糖选择质粒）乳糖选择质粒） 具有更高的拷贝数具有更高的拷贝数 重组体的识别只需要一步重组体的识别只需要一步 拥有更多的多克隆单酶切位点拥有更多的多克隆单酶切位点 五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体 24 pUCpUC载体载体乳糖选择质粒乳糖选择质粒 p (1)(1)来自来自pBR322pBR322质粒的质粒的复制起点复制起点(ori)(ori)； p (2)(2)氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因抗性基因(Amp(AmpR R) )，但它的，但它的DNADNA核苷酸序列已核苷酸序列已 经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；经发生了变化，不再含有

19、原来的限制酶的单识别位点； p (3)(3)大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (laclacZ)Z)的启动子及其编码该基的启动子及其编码该基 因氨基端因氨基端-肽链的肽链的DNADNA序列序列, ,此结构特称为此结构特称为laclacZZ基因基因； p (4)(4)多克隆位点多克隆位点(MCS)(MCS)区段区段：位于：位于laclacZ Z 基因中的靠近基因中的靠近55端，端， 内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不 同粘端的目的同粘端的目的DNADNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不片段可方便地定向插入载体中。但它并

20、不 破坏破坏laclacZ Z 基因的功能。基因的功能。 25 BamHI pUC18 2686 bp Ap r lacZ ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396452 EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII 26 pGEMpGEM载体载体克隆克隆DNADNA的体转录的体转录 p加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切 位点的两侧，可被位点的两侧，可被T7T7噬菌体的噬菌体的RNARNA聚合酶或聚合酶或SP6 SP6 T7

21、T7噬菌体的噬菌体的RNARNA聚合酶的识别聚合酶的识别 p方便了克隆方便了克隆DNADNA的体外转录，便于研究的体外转录，便于研究RNARNA加工，加工， 合成蛋白质等的研究等合成蛋白质等的研究等 五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体 27 多拷贝多拷贝 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS） 正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ 装有两个噬菌体的强启动子用于外装有两个噬菌体的强启动子用于外 源基因的高效表达源基因的高效表达 注意：注意：T7T7和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的 RNARNA聚合酶所识别，因

22、此相应的受体菌必须表达噬菌聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌 体体RNARNA聚合酶，如聚合酶，如E.coli BL21E.coli BL21（DE3DE3） 等等 2743 bp2743 bp MCSMCS laclac Z Z P PT7 oriori ApApr pGEM-3ZpGEM-3ZP PSP6 pGEM-3ZpGEM-3Z： 28 第三节第三节 噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 1 1 噬菌体的基本特征噬菌体的基本特征 裂解周期裂解周期 溶源溶源 2 2 溶源性噬菌体溶源性噬菌体 原噬菌体原噬菌体 溶源菌溶源菌 噬菌体噬菌体，M13M13 29 噬菌体颗粒中的噬菌体颗粒中的

23、DNADNA是一线性双链是一线性双链DNADNA分子，长分子，长48 48 502bp502bp。 基因簇集排列基因簇集排列 线线噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期 线性线性噬菌体两端各有噬菌体两端各有1212个碱基的个碱基的55凸出黏性末端凸出黏性末端 是互补的是互补的, ,该互补序列相互作用形成该互补序列相互作用形成coscos位点。位点。 作用：进入细胞的作用：进入细胞的DNADNA通过两端的黏性末端环化。通过两端的黏性末端环化。 作为内切酶的识别位点作为内切酶的识别位点 一、一、 噬菌体的生物学噬菌体的生物学 30 31 32 1 1、

24、对野生、对野生噬菌体的改进噬菌体的改进 A A、 删除多余的限制性内切酶的位点。删除多余的限制性内切酶的位点。 B B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C C、设计阳性选择重组子的方法。、设计阳性选择重组子的方法。 D D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNADNA的的 RNARNA探针的载体探针的载体 E E、发展可以使插入的真核、发展可以使插入的真核cDNAcDNA与与半乳糖苷酶半乳糖苷酶 形成融合蛋白的载体。形成融合蛋白的载体。 二、基于二、基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体 33 2 2、噬菌体

25、基因组可删除的部分不影响生存能力噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力 噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解 状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关， 即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关 删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环 二、基于二、基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体 34 3 3、噬菌体载体可分为噬菌体载体可分为 q插入型载体：只具有一个可供外源插入型载体：只具有一个可供外源DNADNA

26、插入的克插入的克 隆位点。隆位点。 失去了非必需区失去了非必需区 切点又位于报告基因上，故在切开切点又位于报告基因上，故在切开DNADNA并插入外源基因并插入外源基因 后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选 可插入长度为可插入长度为10kb10kb的外源的外源DNADNA 二、基于二、基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体 35 两种报告基因的插入型载体两种报告基因的插入型载体 cIcI基因内保留基因内保留HindHindIIIIII和和EcoEcoRIRI单酶切位点，当有单酶切位点，当有 外源外源DNADNA在这酶切位点插入时，使在这酶切位点插入时

27、，使cIcI基因失活，基因失活， 感染感染hf-hf-大肠杆菌后可形成空斑（大肠杆菌后可形成空斑（ 如如 gt10gt10） 。 在噬菌体在噬菌体DNADNA插入的插入的lacZlacZ基因末端设有单一的基因末端设有单一的 EcoEcoRR酶切位点酶切位点。在此处插入外源基因，可表达。在此处插入外源基因，可表达 -半乳糖苷酶的融合蛋白半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或，利用特异性抗体或 DNADNA测序方法可测序方法可筛选重组筛选重组DNADNA。这类载体适宜构建。这类载体适宜构建 cDNAcDNA文库文库( (如如ZAPII)ZAPII) 二、基于二、基于噬菌体的噬菌体的克隆载体克隆载体

28、 36 q 替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA DNA区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的DNADNA所取代。所取代。 可克隆的片段大，最大可达可克隆的片段大，最大可达23kb23kb，而质粒最大仅，而质粒最大仅10 kb10 kb左左 右；右； DNADNA的长度的长度大于大于野生型野生型噬菌体噬菌体DNADNA长度的长度的7575而不超过而不超过 其其105105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNADNA的长度短于的长度短于 野生型的野生型的75%75%或超过或超过105%105%时

29、，噬菌体的活性就急剧下降，时，噬菌体的活性就急剧下降， 因此要求因此要求载体载体DNADNA和外源和外源DNADNA长度之和在长度之和在393953kb53kb之间。之间。 二、基于二、基于噬菌体的噬菌体的克隆载体克隆载体 37 三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装 体外包装：体外包装： 模拟模拟噬菌体噬菌体DNADNA分子在宿主细胞内发生分子在宿主细胞内发生 的包装过程，将重组的的包装过程，将重组的噬菌体噬菌体DNADNA分子包装分子包装 成成熟的具有感染能力的成成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒噬菌体颗粒 必要性：必要性： 噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌

30、的效 率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理， DNADNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染的连接产生的有效分子等原因，使得转染 效率更低效率更低 38 三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装 39 三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装 单菌株体系单菌株体系 缺陷型缺陷型噬菌体在噬菌体在coscos位点有突变，位点有突变， 噬噬 菌体的菌体的DNADNA复制不能完成，但可形成外壳蛋白，复制不能完成，但可形成外壳蛋白， 可以制备包装所必须的各种外壳蛋白可以制备包装所必须的各种外壳蛋白。 40 三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装 3 3

31、 双菌株的体外包装原理双菌株的体外包装原理 A A 噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行 B B 头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部 C C 尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部 D D 两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体外装备两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体外装备 形成有活性的噬菌体颗粒形成有活性的噬菌体颗粒 41 Lyse, mix Add ATP and concatemerized DNA Mature phage particles 42 重组噬菌体的鉴别重组噬菌体的鉴别

32、lacZ lacZ基因功能选择方法基因功能选择方法 类似于质粒中的蓝白斑筛选类似于质粒中的蓝白斑筛选 cIcI基因功能选择法基因功能选择法 cI cI 插入失活的噬菌斑是插入失活的噬菌斑是“清澈清澈”的，而野生型的，而野生型 正常的噬菌斑是正常的噬菌斑是“浑浊浑浊”的的 43 5.4 5.4 重组噬菌体的鉴别重组噬菌体的鉴别 SpiSpi- -（s sensitive to ensitive to P P2 2 i inhibitionnhibition）正选择）正选择 A A 野生型野生型噬菌体，不能在噬菌体，不能在P2P2噬菌体溶源性细噬菌体溶源性细 菌中生长，为菌中生长，为SpiSpi+

33、 +， ，即对在 即对在P2P2噬菌体的抑制成噬菌体的抑制成 敏感反应。敏感反应。 B B 噬菌体载体中的噬菌体载体中的redred和和gamgam区段被外源片段取区段被外源片段取 代后，代后， 噬菌体就能在噬菌体就能在P2P2噬菌体溶源性细菌噬菌体溶源性细菌 中中生长。生长。 44 5.4 5.4 重组噬菌体的鉴别重组噬菌体的鉴别 基于基于基因组大小的筛选基因组大小的筛选 包装体系只能将大小包装体系只能将大小37-52Kb37-52Kb的的DNADNA分子插入到分子插入到 噬菌体的头部结构中噬菌体的头部结构中 插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体的中插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体的中

34、非必须的基因部分，因此中有重组后介于非必须的基因部分，因此中有重组后介于 3752Kb3752Kb的分子才能被包装。的分子才能被包装。 45 二、二、M13 M13 噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 M13M13噬菌一般特点噬菌一般特点 仅仅6407 6407 个核苷酸个核苷酸 有双链环状，单链环状存在形式有双链环状，单链环状存在形式 基因组采取滚环复制形式基因组采取滚环复制形式 适合做载体适合做载体 具有比具有比噬菌体更大的装载能力噬菌体更大的装载能力 单链形式在某些实验过程很重要，如测序、体单链形式在某些实验过程很重要，如测序、体 外突变等外突变等 46 47 第四节第四节 外源外源DNADN

35、A和载体的连接和载体的连接 48 1 1、互补黏性末端之间的链接、互补黏性末端之间的链接 同一限制酶切割位点连接：同一限制酶切割位点连接： 由同一限制性核酸内切酶切割的由同一限制性核酸内切酶切割的 不同不同DNADNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNADNA后产生单链后产生单链 突出（突出（55突出及突出及33突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的 DNADNA序列不影响连接，那么，当这样的两个序列不影响连接，那么，当这样的两个DNADNA片段一起退火时，片段一起退火时， 粘性末端单链间进行碱基配对，然后在粘性末端单链间

36、进行碱基配对，然后在DNADNA连接酶催化作用下连接酶催化作用下 形成共价结合的重组形成共价结合的重组DNADNA分子。分子。 一、外源一、外源DNADNA和载体连接的方法和载体连接的方法 49 50 一、外源一、外源 DNA DNA 和载体的连接方法和载体的连接方法 2 2、平末端之间的链接、平末端之间的链接 DNADNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切 酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶 切割切割DNADNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此后产生的平端也属配伍末端，可彼此 相互连接；若产生的粘性末端经特殊

37、酶处理，相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理， 使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可 实行平端连接。实行平端连接。 操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用 量。量。 51 3 3 、将粘末端加到平末端分子上、将粘末端加到平末端分子上 DNA DNA 接头接头 同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端 PCRPCR产物的克隆连接（特例）产物的克隆连接（特例） 一、外源一、外源 DNA DNA 和载体的连接方法和载体的连接方法 52 DNA DNA 接头接头 53 同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多同聚物

38、加尾连接是利用同聚物序列，如多 聚聚A A与多聚与多聚T T之间的退火作用完成连接。在末端之间的退火作用完成连接。在末端 转移酶转移酶(terminal transferase)(terminal transferase)作用下，在作用下，在 DNADNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末 端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，端连接。这是一种人工提高连接效率的方法， 也属于粘性末端连接的一种特殊形式。也属于粘性末端连接的一种特殊形式。 同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端 54 dATP dTTP 55 PCRPCR产物的克隆连接产物的克隆连接

39、 PCRPCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移酶反应中所使用的聚合酶具有末端转移酶 的活性，通常在的活性，通常在33末端加上末端加上A A。 经特使处理的载体具有经特使处理的载体具有3 3 突出突出T T碱基，通碱基，通 过过T/AT/A互补，进行克隆。属于黏性末端的连互补，进行克隆。属于黏性末端的连 接，该克隆方式特称接，该克隆方式特称TATA克隆。克隆。 56 从生物秀网站下载 57 二、定向克隆二、定向克隆 将外源DNA按正确的方向插入载体。通常采用 不同的内切酶分别处理载体和片段，使线性载 体和片段的两段带有不同的粘性末端，通过载 体与片段之间的连接，实现定向克隆。 58 第五节第五节

40、 ：一个基因在：一个基因在E. coli 中的调节表达中的调节表达 59 一、研究目的一、研究目的 研究拟南芥中钙结合蛋白研究拟南芥中钙结合蛋白肌钙网蛋白在花肌钙网蛋白在花 中的功能。中的功能。 需制备该蛋白的抗体需制备该蛋白的抗体 60 二、研究基础二、研究基础 获得了基因的获得了基因的cDNAcDNA克隆克隆 获得了原核表达载体和细菌菌株获得了原核表达载体和细菌菌株 获得了纯化蛋白质用的金属螯合层析柱获得了纯化蛋白质用的金属螯合层析柱 具备免疫家兔的实验技术具备免疫家兔的实验技术 61 三、研究策略三、研究策略 1 1、构建原核表达载体构建原核表达载体 2 2、纯化蛋白纯化蛋白 3 3、免疫家兔、免疫家兔 4 4、检测该蛋白质在花中的表达、检测该蛋白质在花中的表达 62 MCS 将外源片段与载将外源片段与载 体用相同的内切体用相同的内切 酶处理后，连接，酶处理后，连接， 形成重组分子，形成重组分子， 构建表达载体构建表达载体 1 1、如何构建载体？、如何构建载体？ 63 2 2、原核表达载体、原核表达载体pETpET系统能够表达系统能够表达 外源基因的原理外源基因的原