药物对豚鼠离体肠平滑肌的作用及PA2PD2测定的实验方案

1、中药学院综合设计性实验方案学生学号、姓名： 苏鹤桂 谭柏森 钟润桃 彭冠 王衍栋 年级、专业： 06药学实验课程名称：药物对豚鼠离体肠平滑肌的作用及PA2、PD2测定 实验分组号： 填写日期： 09.11.11. 实验名称药物对豚鼠离体肠平滑肌的作用及PA2、PD2测定 项目背景（实验的目的、意义，以及欲解决的问题和国内外研究现状）实验的目的1. 建立豚鼠离体肠平滑肌实验模型；2. 观察阿托品对乙酰胆碱的竞争性拮抗作用3. 掌握pA2、pD2值的测定方法实验意义1 建立方法研究药物拮抗作用2掌握pA2、pD2值的测定方法国内外研究现状分析（一）阿托品对胃肠道的研究状况阿托品可以抑制受体节后胆碱

2、能神经支配的平滑肌与腺体活动，并根据本品剂量大小，有刺激或抑制中枢神经系统作用。解毒系在M-胆碱受体部位拮抗胆碱酯酶抑制剂的作用, 如增加气管、肠道系粘液腺与唾液腺的分泌，肠道平滑肌挛缩，以及植物神经节受刺激后的亢进。此外，阿托品能兴奋或抑制中枢神经系统，具有一定的剂量依赖性。对心脏、肠和肠道平滑肌作用比其他颠茄生物碱更强而持久。（二）乙酰胆碱的研究状况ACh可明显兴奋胃肠道，使其收缩幅度、张力增加，胃、肠平滑肌蠕动增加，并可促进胃、肠分泌，导致恶心、嗳气、呕吐、腹痛及排便等症状。Ach还可使泪腺、气管和肠道腺体、唾液腺、消化道腺体和汗腺分泌增加，使肠道收缩，颈动脉和主动脉体化学受体兴奋。当A

3、Ch局部滴眼时，可致瞳孔收缩，调节于近视。ACh尚可作用于自主神经节和骨骼肌的神经肌肉接头的胆碱受体，引起交感、副交感神经节兴奋，肌肉收缩。由于ACh不易进入中枢，故尽管中枢神经系统有胆碱受体存在，但外周给药很少产生中枢作用。临床常见药物有卡巴胆碱，毛果芸香碱，氯贝胆碱等。（三）M受体对胃肠道的研究状况1）作用机制M受体广泛分布在全身各平滑肌中，包括胃肠道，它在维持全身平滑肌收缩状态时起主要作用。分布在肌纤维膜上的M受体亚型主要为M1和M2其中M2数量占75%-80%，但M3受体是主要的功能类型。许多实验表明，当离体的胃肠平滑肌束接触M兴奋剂时，所引起的收缩对M受体竞争性拮抗剂敏感，这种现象与

4、M3激活机制一致。这种情况可用下述机制解释：M3受体与GQ家族的G蛋白耦联，导致磷脂酶C活化、磷酸肌醇水解，促使三磷酸肌醇和1,2-二酰基甘油水平增高，从而引起钙离子动员，即肌浆网内储存钙离子释放，胞浆内钙离子增多，触发平滑肌收缩。DG水平的增高可激活蛋白激酶C，而使其发生重分布至胞膜，产生磷酸化功能。在大多数情况下，M1,M3,M5亚型的磷酸肌醇反应对PTX不敏感。而M2亚型与GI家族的G蛋白相互作用，介导PTX 敏感性的针对CAMP聚集的抑制反应。M2,M4受体也可通过直接耦联GI,GO蛋白来介导内向整流钾通道的激活和神经元钙通道的抑制，这些离子反应也表现为PTX敏感性。2) M受体在小肠

5、的分布和介导作用1986 年CHOO等采用放射配体法发现M2受体在回肠分布的高度优势倾向。此后，许多实验表明在小肠全层组织中均存在M2,M3受体，其中M2受体比例占多数，M3受体数量大约仅占M2受体1/4。比如，MICHEL等用3H-联苯乙酰氧基甲基六氢吡啶 (M3配体）选择性标记豚鼠回肠纵肌层内的M3受体，发现M3受体密度较低。在豚鼠、大鼠、狗和人的在体、离体及单个平滑肌细胞众多实验中均发现，M3受体是调节小肠平滑肌收缩的主要受体。有实验表明， M3受体特异性拮抗剂等对兔和豚鼠回肠的亲和力与M3受体的活化一致。另外，选择性M 受体烷基化和脱敏实验也表明，M3受体在标准条件下介导回肠收缩，包括

6、纵肌层和环肌层。也有实验证实，M3受体是调节狗小肠移行性运动复合波的主要受体。这些实验的对象大多是全层平滑肌，而有人提出环肌和纵肌的收缩机制可能不一样。SHI等在分别分析狗小肠环肌和纵肌实验后发现，虽然M3受体是调节环肌收缩的主要受体，但M2,M3均参与纵肌的收缩，因为M2受体拮抗剂在离体或在体实验中用较低浓度即可显著抑制纵肌收缩，而对环肌无明显影响。二、实施方案（包括实验的原理或技术路线、实验器材与药品、具体操作过程、每个成员的具体分工、实验的进程安排等）实验原理 1、 激动药与拮抗药 （1）.激动药(agonist)：与受体有亲和力又有内在活性药物。完全激动药(full agonist):

7、 = 1 部分激动药(partial agonist, mixed agonist): 与受体有亲和力，但内在活性较弱 （1）的药物。 （2）.拮抗药(antagonist)：与受体有亲和力，而无内在活性的药物（= 0）。 竞争性拮抗药(competitive antagonist)与激动药竞争同一受体的拮抗药。激动药的量效反应曲线可以被竞争性拮抗药平行右移。非竞争性拮抗药（noncompetitive antagonist）与激动剂作用于同一受体，结合牢固，分解慢或是不可逆的，或作用于相互关联的不同受体。 2、PA2、PD2值 PA2是一种用以表示竞争性拮抗剂作用强度的指标，其意义是能使激动

8、剂提高到原来的2倍时，可产生与原来浓度相同效应所需的拮抗剂克分子浓度的负对数(-log(B)。PA2的值越大说明拮抗剂的作用越强。pA2是拮抗参数(antagonism parameter)：当有一定浓度的拮抗药存在时，激动剂增加2倍时才能达到原来效应，此时拮抗药的负对数即拮抗参数， pA2 = -logI = -logKI PD2：是激动剂与受体亲和力的定量表示。按照Ariens的定义，PD2是产生50最大效应(E=12Emax)的摩尔浓度的负对数(-logD)。PD2值越大，说明药物和受体的亲和力越大，药效越强。计算方法与PA2相似实验材料 乙酰胆碱（mol/L）：10-6、10-5、10

9、-4、10-3、10-2 阿托品（mol/L）：310-7台氏液配制 1000ml台氏液含：NaCl 8.0g、10% KCl 2.0ml(0.2g)、10% MgSO4.7H2O 2.6ml(0.26g)、5% NaH2PO4 .2 H2O 1.3ml(0.065g)、NaHCO3 1.0g、1M CaCL2 1.8ml（0.2g）、葡萄糖 1.0g。离体器官浴池及恒温装置、PowerLab系统、混合气体（95O25CO2）、负荷500 mg、加液器、培养皿、缝针、线、眼科镊子、剪刀。【实验步骤】1离体肠肌的制备猛击豚鼠头部至昏，立即剖开腹腔，自幽门下5cm剪取空肠和回肠上段，迅速置于台氏液

10、液中。小心剪去肠系膜，用吸管吸取台氏液液缓慢冲洗肠内容物；将空肠段分割成2 cm的小段备用，然后用缝针在肠段两端各穿一根线，作为固定肠肌之用。2实验装置将制成的标本一端固定于通气钩上，另一端连接于肌力换能器并接入PowerLab系统的桥式放大器上，浴池内放20ml 台氏液液，加500mg负荷，恒温371C，浴池内持续通入95O2与5CO2的混合气体。3累积剂量效应曲线的制作实验装置完毕以后，打开PowerLab系统，按“操作指南”设置参数：（1）选择channel 1（2）记录速度10 /s（3）Bridge Amplifer中“rang”选择20 mv，“Low Pass”选择50 Hz （

11、4）调零“zero” 描记肠肌收缩曲线，待收缩基线平稳后，按下列（表6-2）次序在浴池中加入预先配好的不同分子浓度的乙酰胆碱。表6-2 累积剂量法加药顺序累加次序药液浓度（mol/L）药液的毫升数（ml）每L中累积剂量（mmol）110-60.20.01210-60.40.03310-50.140.1410-50.40.3510-40.141610-40.43710-30.1410810-30.430910-20.141001010-20.4300随药液的依次加入，浴池内药物浓度不断提高。每加入一个剂量后，约经数秒钟肠肌的收缩达高峰。应在高峰未下降前，迅速加入下一个剂量。当反应到一定高峰，再递

12、增剂量，效应不再增加，此时的效应为最大效应。4阿托品拮抗乙酰胆碱的剂量效应曲线的制作放去浴池中的液体，用台氏液液冲洗三次，以后每隔10min冲洗一次，共冲洗三次，再加入台氏液液至20ml。待收缩基线平稳后，加入阿托品3X107 mol/L 0.2ml，培育15min，再按“方法3”依次加入不同浓度的乙酰胆碱，便可得到有拮抗剂时乙酰胆碱的累积剂量效应曲线，此时拮抗剂（阿托品）摩尔浓度的负对数即pAx。 【统计与处理】1绘制累积剂量效应曲线取方格纸，以肠肌收缩幅度（mv）作为纵坐标即效应（E），以药物对数浓度（lg C）为横坐标，绘制量效曲线。KD值即达到50最大效应时，在横坐标上所对应的药物浓度

13、。 药物的最大效应（Emax）即曲线的高度。当比较同类药物的Emax时，即比较曲线的高度（肠肌收缩最大幅度）。2直线回归（LR）计算参数为了正确求得各参数，必须将曲线直线化。可按D/R式（改良LineweaverBurk式）使剂量效应曲线直线化。 (y) (a) (b) (x)式中：D为药物剂量（浓度），E为某一剂量的效应，KD为药物的解离常数，Emax为药物的最大效应。以D/E为纵坐标，D为横坐标进行直线回归。按直线公式y = a + bx，则Log KD 即pD2根据公式pA2 = pAx + log (x-1)，式中pAx为拮抗剂摩尔浓度的负对数，x为用拮抗剂后与用拮抗剂前KD之比。实验安排 2009/11/2-2009/11/20 制定实验方案，并对方案进行陈述 2009/11/302009/12/1 根据实验方案准备实验材料2009/12/22009/12/3 进行实验 2009/12/4 统计结果及数据统计 2009/12/5-2009/12/8 实验总结及撰写报告 四、参考文献1 葛建国.不合理用药实例分析.中国乡村医药杂志J