联合监测血清IL-23dectin-1受体在早期诊断肺部真菌感染中的临床意义

1、宁波市自然科学基金项目可行性报告联合监测血清IL-23、dectin-1受体在早期诊断肺部真菌感染中的临床意义一. 立项的背景和意义：随着广谱抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素、化疗药物等在临床上的广泛应用以及器官移植、机械通气等生命支持技术的开展，深部真菌感染率呈增长趋势，而肺部由于直接与大气相通，且全身血流均经过肺循环，所以与其他器官相比，在深部真菌感染中侵袭性肺部真菌感染（invasive pulmonary fungal infections,IPFI）最为常见。IPFI多发生在有严重基础疾病的患者，其预后差，病死率高，其中念珠菌病病死率达30%-40%，曲霉菌病病死率达50%-100%，

2、在大器官移植患者中肺部侵袭性真菌感染已成为患者死亡的重要原因【1、2】。深部真菌感染的疗效及转归很大程度上取决于早期诊断、早期规范治疗。尽早诊断对深部真菌感染的治疗和预后有重要作用。长期以来，IPFI的诊断主要依靠观察患者临床症状、微生物实验室检查、组织病理学检查以及宿主因素进行综合判断，但患者临床症状缺乏特异性且被细菌感染所致的原发病变所掩盖而不易识别。微生物学实验室检查主要包括直接涂片和真菌培养两种方法，前者是最经典的方法，简便、快速，但阳性率低，且不易识别是定植菌或污染菌。真菌培养虽然可以明确到种，还可做药敏试验，指导临床用药，但其检测周期长且不易识别是定植菌或污染菌。组织病理学检查是真

3、菌感染诊断的“金标准”，但其属于创伤性诊断技术其应用受到病情的限制，同时其阳性率可受操作者技术水平的影响，且该方法的周期较长，可造成诊断的延迟和病死率的增加。近年来，一项新的血清学检测指标血清1、3-葡聚糖经美国FDA批准用于具有侵袭性肺部真菌感染症状或危险因素的患者作为IPFI的早期辅助诊断，但该指标不能用于隐球菌及接合菌的辅助诊断，同时其应用价值仍需临床进一步研究。因此寻找一种安全、快速、敏感及特异的免疫学指标对IPFI作出早期诊断显得极为重要。dectin-1受体作为固有免疫的重要组成部分，在IPFI的发生机制中起着重要的作用。采用流式细胞仪对患者外周血单核细胞中dectin-1受体的检

4、测，同时结合患者血清IL-23水平有望对IPFI作出早期诊断，从而及早采取诊治措施。本课题主要研究大鼠肺部被真菌感染后，外周血及病变组织单个核细胞中dectin-1受体的表达及血清IL-23水平与IPFI发生及病变程度的关系，评价dectin-1在IPFI中的实验室早期诊断价值。二. 国内外研究开发现状和发展趋势（包括知识产权状况）：肺部真菌感染是一种严重危害患者身体健康的疾病，其临床表现无特异性，早期诊断困难，病情常被原发病掩盖，容易漏诊、误诊，延误最佳治疗时机。同时抗真菌药物不合理使用现象时常发生，因此肺部真菌感染的早期诊断已经成为迫切需要解决的临床问题。肺部真菌感染的发生与病原体的致病力

5、、宿主防御力等因素密切相关。尽管对于其中涉及的许多机制尚不完全明确，但近些年的研究表明宿主与真菌接触后通过C型凝集素受体识别自己和非己的过程是机体发生固有免疫的基础。dectin-1受体作为C型凝集素受体家族的一个重要成员在IPFI的发生机制中起着重要的作用。C型凝集素受体（CLRs）是一个庞大的蛋白超家族，含一个或多个结构相关的C型凝集素杨结构域（CTLD）。依据结构和种系发生不同，CLRs被分为17个型，已有的研究表明，几种胞外和跨膜CLRs，包括树突状细胞相关C型凝集素-1（dectin-1）、dectin-2、DC-SIGN、甘露糖受体和胶原凝集素与抗真菌免疫有关，这些受体介导对真菌的

6、黏附、摄取和杀灭，激起和（或）调节机体的免疫反应。dectin-1受体是由C型植物血凝素样碳水化合物识别域、短杆和具有免疫受体酪氨酸激酶活化基序（ITAM）的胞质尾部构成3。其C型植物血凝素折叠结构与自然杀伤T细胞类似，缺乏参与钙离子调节的残基，因而与钙离子依赖性C型凝集素结合碳水化合物相比，dectin-1受体结合配基呈非金属离子依赖性。最初的研究认为dectin-1受体是树突状细胞特异性受体，但后来发现dectin-1受体还广泛表达于单核巨噬细胞系统、中性粒细胞和成纤维细胞等4。研究发现dectin-1受体在脑、肌肉和皮肤以外的大多数组织中均有表达，以肝、肺和胸腺表达水平最高5。真菌细胞壁

7、主要由碳水化合物（如-葡聚糖、甘露糖）、蛋白质和脂质组成，-葡聚糖很特殊，在哺乳动物细胞不表达，这种碳水化合物能够作为潜在的生物反应调节物起作用，对免疫系统起到多种作用，如抗肿瘤活性、抗感染活性（包括抗真菌、细菌、病毒、原虫感染等）6。吞噬作用在控制真菌感染中起关键作用，是清除真菌病原体的重要机制。 dectin-1受体作为-葡聚糖的主要受体能够结合多种真菌，包括酵母菌、白色念珠菌、卡氏肺囊虫、隐球菌和曲霉菌等7，介导对真菌的吞噬作用。最近的研究发现它还能介导巨噬细胞对分枝杆菌感染的应答8。致炎介质（细胞因子和趋化因子）的产生，是控制真菌感染的必需早期步骤，致炎介质产生的缺陷将导致对真菌病原体

8、敏感。dectin-1受体识别-葡聚糖后，能够通过其胞质内免疫受体酪氨酸激活样基序介导细胞内信号转导，调节细胞因子和趋化因子的产生，包括INF、巨噬细胞炎症蛋白2、IL-2、IL-10、IL-6和IL-23等。Brown9认为前炎症因子和趋化因子的产生，需要TLR发热协同作用。但随着进一步的研究发现通过dectin-1受体的信号能够直接偶连适应性免疫应答10。另外，dectin-1受体在与-葡聚糖结合后能诱导氧爆发，这是吞噬细胞的主要杀菌机制，对真菌杀伤是必需的，尽管Fc受体介导的调理素识别机制也能够诱导氧爆发，但dectin-1受体显示出更为显著的作用。白介素-23（IL-23）是近几年发现

9、的一种白细胞介素，与白介素-12（IL-12）有40%的基因同源性11，由p19和p40两个亚基组成的二聚体，主要由活化的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞产生。IL-23可以对多种细胞发挥作用，促进细胞因子的分泌，产生相应的细胞效应，从而在抗真菌感染免疫机制中起着重要的作用。Leibund Gut-landmann等12和Shinobu Saijo 13等的研究表明dectin-1受体可诱导树突状细胞成熟并分泌促炎性细胞因子IL-6、TNF、IL-23以及IL-12的分泌,产生的IL-23可诱导辅助型T细胞17分化产生白介素17（IL-17）。IL-23通过诱导Th17细胞分化产生IL-17在抗

10、真菌感染中起着重要作用。 Contin等14使用小鼠口咽念珠菌感染模型研究发现，Th17细胞通过IL-17在抗念珠菌感染中发挥着重要的作用。Kleinschek MA等15研究发现IL-17在真菌感染中参与了保护性免疫应答如系统性新型隐球菌感染，Runder KL等16的研究也表明了IL-17参与了对抗卡氏肺囊虫的宿主防御反应。而Zelante T等17使用胃肠道白念珠菌感染和肺曲霉病小鼠模型研究发现，增高的IL-23/Th反应使小鼠对白念珠菌和曲霉菌的易感性增加，IL-23/ IL-17途径抑制了保护性的Th1型抗真菌反应，起到了负调节的作用。 总之dectin-1受体通过它的识别作用、介导

11、细胞内摄作用、对-葡聚糖促炎症反应的诱导作用（诱导树突状细胞成熟并分泌促炎性细胞因子IL-6、TNF、IL-23），L-23通过诱导Th17细胞分化产生IL-17，在抗真菌免疫的机制中起着重要的作用。目前对于dectin-1受体在抗真菌免疫的作用，主要集中于临床治疗性药物设计靶点的研究，而对于其在真菌感染尤其是IPFI早期诊断中的价值，尤其是联合监测两者在IPFI早期诊断中的价值国内外目前相关报道甚少。参考文献1 Nucci M, Marr KA. Emerging fungal disease J . Clin Infect Dis, 2005 ,41 ; 521-526. 2 Fridki

12、n SK . The changing face of fungal infections in health care seltin J . Clin Infect Dis, 2005 ,41 ;1455- 1466. 3 Ariizumi K,Shen GL,Shikano S et al.Identification of a novel,dendritic cell-associated molecule,Decitin-1,by subtractive cDNA cloning.J Biol Chem,2000,275(26):201574 Sobanov Y,Bernreiter

13、A,Derdak S et al.A novel cluster of lectin-like receptor genes expressed in monocytic,dendritic and endothelial cells maps close to the NK receptor genes in the human NK gene complex.Eur J Immunol2001,31(12):34935Taylor PR,Brown GD,Reid DM et al.Thebeta-glucan receptor,Dectin-1,is predominantly expr

14、essed on the surface of cells of the monocyte/macrophage and neutrophillineages.J Immunol,2002,169(7):38766Brown GD, Gordon S.Fungal beta-glucans and mammalian immunity. Immunity,2003,19(3):3117 Taylor PR,Tsoni SV,Willment JA,et al.Dectin-1 is required for beta-glucans recognition and control of fun

15、gal infectionJ.Nat immuol,2007,8(1):31-388 Schorey JS,Lawrence C.The pattern recognition receptor Dectin-1:from fungi to mycobacteriaJ.Curr Drug Targets,2008,9(2):123-1299 Brown GD. Dectin-1:a signaling non-TLR pattern-recognition receptorJ.Nat Rev Immunol,2006,6(1):33-3410 Willment JA, Brown GD.C-t

16、ype lectin receptors in antifungal immunolJ.Trends Microbiol,2008,16(1):27-3211 Oppmann B,Lesley R,Blom B,et al.Novle p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine Il-23,with biological activities similar as well as distinct from IL-12J.Immunity,2000,13(5):715-72512 Leibund Gut-landmann S,Gross O,

17、Robinson MJ,et al.SYK-and-CARD9-dependment coupling of innate imminity to the induction of T helper cells that produce interleukin 17J.Nat Immunol,2007,8(6):630-63813 Shinobu Saijo,Yoichiro Iwakura.Dectin-1 and Dectin-2 in innate immunity against fungiJ.Int Immunol.,2011,23(8):467-47214Contin HR,She

18、n F,Nayyar N,et al.Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasisJ.J Exp Med,2009,206(2):299-31115Kleinschek MA,Muller U,Brodie SJ,et al.IL-23 enhances the inflammatory response in Crytococcus neformans infection and induces a Cytokine pattern

19、 distinct from IL-12J.J Immunol,2006,176:1098-110616Runder XL,Happel KI,Young EA,et al.Interleukin-23(IL-23)-IL-17 Cytokine axis in murine pneumocystis Carimni infection J.Infect Immune,2007,75(6)：3055-306117Zelante T,Deluca A,Bonifazi P,et al.IL-23 and the Th17 pathway promote inflammation and impa

20、ir antifungal immune resistanceJ.Eur J Immunol.2007,37(10):2695-2706三. 申报单位研究条件：本院检验科具有较先进的设备，对于血液等标本的检测方法准确、成熟，掌握多项先进的流式细胞和免疫学实验技术；呼吸内科对于动物实验过程、操作方法、步骤及应用的掌握较为成熟。本院与宁波大学医学院合作建成的动物实验室设备比较完善，基本具备所需要的设备及技术。四. 项目负责人的主要学术成就和技术指导能力、技术团队研究水平：项目负责人，副高，1998年至今，一直从事医院感染管理工作，现任医院感染管理科科长，曾主持了非典、麻疹、甲流、肺结核等多起突发公

21、共卫生事件的防控任务，在感染控制领域有较高的造诣并享有很高的威望，擅长于医院感染的预防与控制，对疑难感染的综合诊治有独到之处，尤其是肺部真菌感染诊治方面开展了多年的临床观察和较为深入的研究，积累了丰富的实践经验，近年来，撰写了相关论文十余篇发表在国内外医学专业期刊上，此外，还具有很高的综合素质和极强的组织协调能力。负责微生物检验人员，副高，多年从事微生物实验室工作，对病原微生物深有研究，在各类相关杂志上发表论文数十篇，曾参与多项课题的完成。负责病理学检测人员，副高，也多年从事病理学检测工作，对病理学诊断方面有丰富的经验，曾主持多项课题的完成，在各类卫生刊物上发表论文十余篇。研究团队其他人员均具

22、有良好的业务水平及科研能力，本团队人员工作踏实、认真，观察细仔、负责，有较强的科研协作精神，完全能胜任课题的研究，并保证课题研究的能顺利完成。五. 项目目标、研发内容：1.研究目标： 研究肺部真菌感染时外周血及病变组织中dectin-1受体的表达情况及血液中IL-23的水平，观察外周血单核细胞中dectin-1受体以及IL-23的表达与肺部炎症病变程度的关系，观察外周血单核细胞中dectin-1受体升高到何种程度对肺部真菌感染具有临床诊断价值，为肺部真菌感染的早期诊断寻找一个快速、安全、敏感、特异的免疫学诊断指标。2研究内容： 检测大鼠接种前外周血单核细胞中dectin-1受体的表达情况以及血

23、液IL-2、IL-23、1、3-葡聚糖以及血液中性粒细胞水平。 将215只Wistar大鼠分为7组,分别为肺部曲霉菌感染组30只、白假丝酵母菌感染30只、隐球菌感染组30只、肺炎链球菌感染30只、肺炎克雷伯菌感染组30只、真菌口咽定植组45只（包括曲霉菌组15只、白假丝酵母菌组15只、隐球菌组15只）、健康组20只。采用气管插管滴入各种病原菌悬液，构建动物模型。采用气管插管滴入各种病原菌悬液，构建动物模型。接种后将肺部曲霉菌感染组、白假丝酵母菌感染组、肺部隐球菌感染组、细菌感染组大鼠再随机平均分为5组，每组6只，将真菌口咽定植组分随机为5组，每组3只。分别在术后1、2、3、5、至死亡当天抽取外

24、周血对单核细胞中dectin-1受体及血清IL-23以及其他相应指标进行动态监测。同时处死大鼠取出其感染肺，切取部分送病理科进行常规病理学及免疫荧光检查，部分送检验科进行组织培养，再取部分进行单个核细胞分离，采用流式细胞仪测其dectin-1受体的含量。对大鼠接种前后各项指标进行分析比较，并将接种后外周血单核细胞中dectin-1受体的表达情况以及血清IL-23水平与其他的各项检测指标进行相关性分析；同时对外周血单核细胞中dectin-1受体的表达情况与病变组织中dectin-1受体的表达情况进行比较，并与病理学检查结果进行比较；观察外周血单核细胞中dectin-1受体的表达与肺部真菌感染及炎

25、症病变程度的关系；联合监测血清IL-23、dectin-1受体能否提高实验室诊断的敏感性；外周血单核细胞中dectin-1受体升高或降低到何种程度具有临床诊断价值。 观察何种指标对肺部真菌感染的发生监测作用更为敏感，特异性更高。六. 技术关键和实验方法：1.技术关键：构建肺部感染动物模型：构建肺部感染动物模型是本实验研究中的一个关键问题。我们参照侵袭性肺部真菌感染动物模型制作及血浆-葡聚糖检测的诊断价值一文介绍的模型制作方法，同时在既往动物实验的基础上，结合国内外文献，在动物实验室中构建该动物模型，本院与宁波大学医学院已建立了合作关系可确保实验顺利进行。肺组织单个核细胞的分离是本实验中的另一关

26、键问题，我们在已掌握技术的基础上与宁波大学医学院进行横向合作，确保实验顺利开展。采用流式细胞仪技术准确检测单核细胞中dectin-1受体的表达，采用酶联免疫吸附试验检测血清IL-23水平是本实验中的又一关键问题，我们拟在本研究小组人员既往实验技术的基础上，准确测定其含量。2.实验方法：1构建肺部真菌动物模型：真菌感染动物模型：用生理盐水分别将曲霉菌、白色假丝酵母菌、新型隐球菌配制成1*109CFU/ml混悬液，将250g左右wister大鼠给予水合氯醛麻醉并固定后，用自制气管插管插入大鼠气管内，将曲霉菌、白色假丝酵母菌、新型隐球菌悬液分别注入大鼠气管内，每次注入混悬液约0.3-0.4毫升，每日

27、一次，连续三天，接种前3天开始肌肉注射地塞米松，每只大鼠给予地塞米松0.15毫克，直至接种结束；细菌感染动物模型：用生理盐水分别将肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌配制成1*108CFU/ml混悬液，分别注入体重约250g左右wister大鼠气管内，具体操作及地塞米松的使用同真菌感染组模型。真菌口咽定植组模型：用生理盐水分别将曲霉菌、白色假丝酵母菌、新型隐球菌配制成1*106CFU/ml混悬液，通过鼻腔和口咽部滴入方法分别将这三种混悬液接种于真菌口咽定植组模型大鼠，每只大鼠滴入混悬液的量约为0.3毫升左右，连续接种3天，地塞米松使用方法同真菌感染模型组，健康组大鼠只给予同量的地塞米松肌肉注射，不做其他任

28、何处理。2 肺组织单个核细胞的分离：处死大鼠取出其感染肺经用RNase-free生理盐水冲洗后于200目筛网研磨过滤，转移至50毫升离心管中冰浴自然沉降10分钟后弃自然沉降物，1000rpm离心10分钟收集细胞；加入1毫升红细胞裂解液后冰浴5-10分钟后用10毫升1PBS溶液终止反应。1000rpm离心10分钟收集细胞，并用1PBS溶液洗涤一次，收集到的细胞即为单个核细胞。3采用流式细胞仪检测外周血单核细胞中dectin-1受体：按照所购买试剂使用说明书操作；对于感染肺分离所得的dectin-1受体表达检测方法为：对于收集到的单核细胞用大鼠血清处理细胞4C30分钟，以封闭表面的非特异性抗体结合位点，取适量待测的荧光抗体加入细胞悬液中，4C避光放置30分钟后用1PBS溶液洗涤2次。标记好的细胞通过coulter epicsxl 仪器检测，所得数据用WinMDI2.8