口蹄疫亚洲I型抗体液相阻断ELISA作业指导书

1、 第二章 作业指导书 第 1 页 共 3 页 口蹄疫 A 型抗体液相阻断 ELISA 第一版 第 0 次修改 起草人： 作业指导书 2011 年 04 月 日颁布、实施 SQSYK-ZYB-004-1.0 1适用范围 试剂盒来自中国农业科学院兰州兽医研究所，适用于亚洲 I 型口蹄疫抗体检测。 2. 器材准备 2.1 移液器： 5-50ul 移液器、 0.2-10ul 移液器、 50-200ul 移液器、 50-300ul 移液器各一把。 2.2 移液枪头。 2.3 抗原抗体反应板：微量血凝板（ U 型、 V 型均可） 5 块，试剂盒配备两块，用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。 2.4 超纯水，

2、无离子水或蒸馏水。 3. 试剂准备 3.1 包被缓冲液（ PH9.6） 将试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊 1 粒小心打开，将胶囊内粉末小心倒入 100ml 无离 子水中溶解即可。 4存放， 1 月内有效。 3.2 洗涤液（ PBST） 将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST液（可能有结晶形成， 用时微热溶化） 用无离子水或蒸馏水做 1:25 稀释。（如果 PH降低，务必用 NaOH调制 7.4 ） 3.3 底物溶液 取 1 片柠檬酸 - 磷酸盐片剂（试剂盒配备）溶于 100ml 无离子水中，溶解后，取 50ml 溶液，再加 1 片邻苯二胺（ OPD）片剂，充分溶解，分装（ 瓶或 瓶），避光 -

3、20 保存。用前避光溶化，临用时每 1ml 上述溶液加 10ul3%的双氧水（ H2O2 ）。务必加双氧水！ 4. 操作步骤 4.1 用包被缓冲液稀释亚洲 I 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（ 1:1000 ） , 在 ELISA 板上 每孔加 50ul ，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。 4.2 抗原抗体 （阴阳性对照血清及待检血清） 反应根据不同的需要， 选择图 1-2 中的一种布 局在抗原抗体反应板上操作。 图 196 孔酶标板检测 10 份样品布局图 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S11：8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32

4、 B 1:16 1:64 C 1:32 1:128 D 1:64 1:256 E 1:128 1:512 F 1:256 1:1024 G 1:2048 H 1:512 1:1024 1:4096 图 1 为抗体滴度测定（定量）检测 10 份样品布局图；图 2 为抗体滴度测定（定量）检测 20 份样品布局图。 1:4 1:8 病毒 抗原 对照 作业指导书 第二章 第 2 页 共 3 页 口蹄疫 A 型抗体液相阻断 ELISA 第一版 第 0 次修改 起草人： 作业指导书 2011 年 04 月 日颁布、实施 SQSYK-ZYB-004-1.0 图 296 孔酶标板检测 20 份样品布局图 1

5、2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S11：32 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 1:4 B 1:64 1:64 1:8 C 1:128 1:128 D 1:256 1:256 E S111:32 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 1:512 病毒 F 1:64 1:1024 抗原 G 1:128 1:2048 对照 H 1:256 1:4096 以图 1 为例，在 U 型血凝板上按 孔量用 PBST 将待检血清从 1:4 开始做 2 倍连续 稀释至 1:512。同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔

6、加入 50ul 用 PBST 稀释到使用 浓度的亚洲 I 型口蹄疫病毒抗原（ 1:8，即 1 份病毒抗原加 7 份 PBST ），病毒抗原对照孔加 100ul 。振荡混匀，封板， 4过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从 1:8 开始的 2 倍稀 释。 4.3 用洗涤液（ 1 PBST）连续洗 ELISA 板 5 次，在吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从 抗原抗体反应板上按次序转移至 ELISA 板上的相对应孔，每孔 50ul ，封板， 37温育 1 小 时。 4.4 同上洗版 5 次，甩干。用豚鼠兔抗血清稀释液稀释亚洲 I 型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工 作浓度（ 1:1000 ），每孔加 50

7、ul ，封板， 37温育 1 小时。 4.5 同上洗版 5 次，甩干。用 1 PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（ 1:1000 ），每孔 加 50ul ，封板， 37温育 1 小时。 4.6 同上洗版 5 次，每孔加 50ul 底物溶液（务必加双氧水） ， 37温育 15 分钟。每孔再加 50ul 终止液终止反应，立即在 492nm波长下读取光吸收值（ D 值）。 492nm 5 结果判定 5.1 试验认可标准 每块板设4 孔病毒抗原对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用 PBST 稀释至使用浓 度，与血清 病毒抗原复合物同步加入ELISA 板孔，孔，病毒抗原对照D492nm 值应在 1

8、.5 0.5 范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024 1 滴度以内，阴性对照血清抗体效价应1:8 。 5.2病毒抗原对照平均D492nm值 50%计算（临界值） 抗原对照孔是4 孔，弃去最高和最低D492nmOD值，计算剩余2 孔的平均D492nm，再除以 2， 作业指导书 口蹄疫 A 型抗体液相阻断 ELISA 作业指导书 SQSYK-ZYB-004-1.0 即 50%对照值。该值即为临界值，表示阻断 5.3结果判定 第二章 第3页共3页 第一版 第 0 次修改起草人： 2011 年 04 月日颁布、实施 50%反应的对照D492nm值。 以病毒抗原对照平均D492nm值的 50%为临界值，被检血清稀释孔D492nm值大于临界值的孔 为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔，阳性孔的D492nm 值等于临界值时所对应的稀释 度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均D492nm值为 1.2 ，则其 50%为 0.6 。若某一 待检血清在1:128 时 D492nm值为 0.6 ，则该份待检血清的抗体滴度为1:128 。若临界值处于两 个滴度之间，如处于1: