丙型肝炎病毒非结构蛋白3解旋酶保守性表位单克隆抗体及其意义

1、丙型肝炎病毒非结构蛋白 3 解旋酶保守性表位单克隆抗体及其意义丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV感染而引起的严重威胁人类健康的传染性疾病。全球约有1.3-1.7亿HCV感染者,大约20刑以自然 清除,80%发展为HCV慢性感染。10-20%勺HCV慢性感染会进一步发展为慢性进行性肝病，包括肝硬化、肝细 胞癌等。HCV是一种非甲非乙型肝炎病毒，后命名为丙型肝炎病毒，归属于肝炎病 毒属 (Hepacivirus),黄病毒科(Flaviviridae) 。HCV病毒体呈球形，为单股正链RNA病毒。HCV-RN全长约为9.6kb,包括 个位于基因中央的开放阅读框 (O

2、RF)。该阅读框编码 3000 多氨基酸的前体多聚蛋白 , 其通过宿主和病毒的蛋白酶 作用被切割成10个具有独立功能的HCVS白,根据功能的不同分别命名为核心蛋 白 Core (C), 包膜蛋白 (envelope protein)1 、 2(E1 、 E2), p7 和非结构蛋白 (nonstructural protein) NS2、NS3 NS4A NS4B NS5A和 NS5B NS3蛋白是 HCV 病毒复制中重要的功能蛋白之一，发挥丝氨酸蛋白酶，解旋酶和NTP酶活性，成为 当今HCV诊断，治疗和预防的研究热点。NS3蛋白N末端1/3具有丝氨酸蛋白酶活性，与NS4A勾成复合体，对多聚蛋

3、 白前体起到剪切作用。C末端2/3氨基酸构成HCV NS解旋酶(helicase),发挥 三磷酸腺苷酶(ATPase)和解旋酶作用，使双链RNA解旋,对HCVRN复制起到重要 作用。此外，研究表明,NS3解旋酶含有大量B细胞优势表位，能在HCV感染早期诱 导机体发生体液免疫反应，产生抗体。因此NS3蛋白(11921457aa)常用作HCV 抗体 EIA 检测试剂盒中的包被蛋白。近年来,由于NS3蛋白功能的进一步明确,发现NS3解旋酶区域中包含大量的 高度保守的功能区,例如,模序I (Walker A:207GSGKS21是ATP吉合位点,在ATP 水解中发挥作用。因此，NS3解旋酶成为抗HCV

4、病毒复制的理想靶位。研究者致力于抑制剂与NS3解旋酶的相互作用,来研发新一代NS3解旋酶抑 制剂。在本课题中，制备了大量抗HCVNS解旋酶的单克隆抗体(单抗),研究单抗 识别表位位点及意义，并进一步研究单抗对HCVNS功能的影响，探索表位氨基酸 位点和单抗在HCV诊断与治疗中的潜在价值。我们从含有HCVNS3(lb型)全长基因的质粒PMD20NS2-4中,扩增NS3目的基 因,并构建表达载体PET-32a-NS3,采用基因原核表达系统进行目的基因表达。 可 溶性蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化,获得纯度约为90%勺截短型NS3蛋白 (1192-1459aa) T-rNS3 。以T-rNS3蛋白

5、为抗原免疫BALB/C小鼠,采用鼠脾细胞与骨髓瘤细胞杂交技 术制备抗HCVNS单克隆抗体。此外,我们获得了三种NS3全长蛋白：一种是从转 染pTY-CMV-NS质粒并稳定表达 HCV NS3S白的293T细胞中获得重组 NS3蛋白 (FL-rNS3); 种是从转染HCV2a型RNA(JFH-1)的Huh7.5.1细胞中获得的天然NS3蛋白；还有一种为纯度为95%勺商品化蛋白FL4b-rNS3,用来进行解旋酶体外 功能实验。为确定B细胞表位,设计并合成了 47条多肽。其中,29条为重叠7个氨基酸 的长度为16个氨基酸长肽,12条为根据长肽P05 P21设计的短肽,5条为根据P05 P21与其他亚

6、型HCV.GB病毒C比对结果设计的突变肽,一条布鲁士杆菌16 肽作为阴性对照。用合成肽通过peptide-ELISA和竞争抑制ELISA方法与单克隆抗体反应,对 抗体识别表位进行确定。通过 ELISA、Western-Blot 和免疫荧光染色 （IFS） 等方 法,用T-rNS3蛋白,FL-rNS3蛋白,天然NS2蛋白,FL4b-rNS3蛋白对单克隆抗体进 行鉴定并对抗体识别表位进行分类。为确定线性表位的保守性,我们从Gen Ba nk数据库中随机选取了大量HCV不 同亚型和黄病毒科其他病毒的氨基酸序列与线性表位氨基酸进行比对。 根据比对 结果合成突变肽,分别与单抗进行ELISA反应,分析线性

7、表位的保守性和单抗的 特异性。为确定线性表位的免疫优势性 , 通过 peptide-ELISA 方法对源于我国广东和 北京地区献血者中的HCV感染者和健康献血者进行研究，测定表位多肽与血清中 抗体的反应性，与常规两种不同血清抗体EIA试剂盒筛查和核酸检测结果相比较， 评估表位多肽ELISA检测与常规方法检测的符合率。根据两种EIA方法测定抗体 和PCF方法测定病毒载量的结果,将136份HCV感染样本分为50份自然康复性 （RNA-/Ab+）和86份慢性（RNA+/Ab+）.以128份健康人血样作为阴性对照,确定健 康人血清抗体水平（S/CO值：mean+2SD,95可信区间）,以此评估多肽与H

8、CV阳性 样品的反应阳性率,绘制ROCi线并确立最优Cut-off值,并以此计算得到表位多 肽与抗体反应的灵敏度、特异性、阳性预测值 （PPV）和阴性预测值（NPV）。用 Kolmogorov-Smirnov Z 分析 ROCS与标准值(0.5)的差异。用 PearsonChi-Square检验比较表位多肽分别与HCV慢性感染样品和HCV!然康复性样品 反应两组之间的差异。此外,我们还通过体外HCVNS解旋酶活性检测实验，评估单克隆抗体对解旋酶的抑制作用程度。用单项方差分析和Dunnett s T3法来比较实验组和对照组 的差异 ,P<0.05 即为差异显著。通过以上实验方法 , 用杂交

9、瘤技术制备了 29 株单克隆抗体。 单抗分别与多肽 进行ELISA反应,结果示,有6株单克隆抗体识别8条16个氨基酸的长肽,其中单 抗1C11所识别的P13P14可以示为一条表位氨基酸序列,而1A10所识别的P09P16是一条不连续的线性表位序列。因此, 表位筛选共获得 5 条连续性的线性表位和一条非连续性的线性表位。29株单抗与重组NS3蛋白和天然NS3蛋白的West on-blot结果显示：27株与变 性的T-rNS3反应；8株与变性的FL-rNS3反应,其中3株与变性的天然蛋白反应。与重组NS3蛋白和天然NS3蛋白的IFS结果显示：10株单抗与非变性的FL-rNS3蛋白反应；7株与非变性

10、的天然FL-rNS3蛋白反应,其中六株（mAb2E12, mAb4B4, mAb3E5, mAb3H3, mAb5F6, mAb6G与 FL-rNS3 蛋白交叉反应,一株 （mAb5C9不反应。通过上述结果,将29株单抗识别的HCVNS抗原表位分为线性 （6 株）、构象性（3 株）、半构象性（3 株）三个类型（其余 17株未分类）。识别线性表位的单抗中,单抗2E12和3E5与天然NS3蛋白结合。为精确这两株单抗识别的表位,我们用短肽与单抗预孵育的混合物通过ELISA方法和16个氨 基酸的长肽进行竞争抑制；并用短肽包被 , 与单抗进行 peptide-ELISA 。结果示,2E12识别的表位EP

11、05为205PTGSGKSTKQ角E5识别的表位EP21 为346EIPFYGKAIPIETIKG361 亥表位其核心氨基酸序列为 347IPFYGKAI354分析 两条表位在HCVNS蛋白中的位置,发现EP05所在位置覆盖了 NS3军旋酶中的ATP 结合位点（207GSGKS211）, EP21的位置接近核苷酸结合位点。将两条表位氨基酸与HCVM他亚型和黄病毒科其他病毒的相似位点的氨基 酸序列进行比较，分析线性表位的特异性与相似性。发现EP05氨基酸序列与不同亚型HCV和黄病毒科非人类感染病毒 GB病毒B相似位点的氨基酸完全相同,与人 感染病毒GB病毒C相近(存在K208A变异)；根据变异情

12、况,设计突变肽GP05 (K208A),结果示单抗2E12不与GP05反应,说明EP05在HCV各个亚型中完全保 守, 在人感染性的黄病毒科中高度特异。EP21与不同亚型的HCV!似序列相比较,氨基酸呈现高度保守性,仅在少数 亚型中有I347V、K352RI354L变异,与黄病毒科GB病毒C比较存在K352HA353G 变异；Peptide-ELISA 结果示,单抗 3E5不与 VatP2101(I347V)、VatP2102(K352R) 和 GP21 (K352H 和 A353G)反应，与 VatP2103(I354L)弱反应。但是，在 ELISA和IFS中,单抗3E5与含有1347V和K

13、352R突变位点的FL-rNS3(4b型)和天然NS3 蛋白(2a型)反应阳性，说明EP21核心区域上述位点氨基酸的改变，可能影响表位 在线性条件下与单抗的结合 , 但在空间状态下 , 由于游离表位氨基酸的结构复杂 性, 即使上述位点氨基酸改变也不影响与单抗的反应。单抗2E12和3E5均不与登革热病毒发生交叉反应。进一步证明了单克隆抗 体能特异性结合HCVNS蛋白。为评估高度保守性表位与HCV感染性样品中抗体反应的潜在优势，通过Peptide-ELISA 方法,用含有表位EP05的长肽P05和含有表位EP21的长肽P21 对136份HCV感染性血液样品(86份慢性感染：RNA+/Ab+;50份

14、自然康复:RNA-/Ab+)和128份健康者血液样品(RNAJAb-)进行筛查。根据长肽与健康者血 样反应结果,通过计算mean+2SD得到Cut-Off值分别为0.267(P05)和 0.298(P21) 。以此计算P05和P21与慢性感染样品反应的阳性率分别为 79.1%和 59.3%,显著高于与自然康复性样品反应的阳性率58%和 30%(P&It;0.001)。以P05和P21 分别与 214份血样(86 份慢性感染样品和 128份健康献血者样品 ),178 份血样(50 份自然康复性样品和 128份健康献血者样品 ),264 份全部样品(86 份慢性感染样 品、50份自然康复性样品和1

15、28份健康献血者样品)的ELISA结果与标准检测结 果进行符合率比较,绘制ROC线。结果示,P05和P21与214份血样反应曲线下面积分别为 0.930、0.859 ;0.843、P05 ,P21与178份自然康复性感染和健康人血清反应的曲线下面积分别为0.782 ; P05,P21与264份全部血清反应的曲线下面积分别为0.898、0.830。两 条多肽对于诊断HCV均具有显著意义(P<0.001)。P05、 P21 两个表位多肽与常规法检测结果的符合率分别为73%、 88%,是 HCV 的两个优势抗原表位。 由上述结果及分析可知 ,单抗 2 E 1 2识别表位覆盖了解旋酶 区域I的A

16、TP结合位点，这样抗体与表位的结合就有可能对解旋酶的功能造成影 响。为了对此进行研究 , 我们在体外进行解旋酶活性功能实验。按不同浓度将高 纯度4b型重组全长NS3蛋白(FL4b-rNS3)与DNA底物混合，FL4b-rNS3发挥解旋 功能,将双链DNA解旋为单链,释放FAM荧光。仪器通过对荧光的检测，来评估解旋酶的效率。结果示：随着 FL4b-rNS3浓 度的增加,解旋效率越高。根据解旋酶活性功能实验结果,将适当浓度的mAb2E1环口一株非相关抗体 (作为阴性对照)分别与FL4b-rNS3预孵育后的混合物加入到 DNA底物中。通过荧 光检测结果,可以发现mAb2E1訓以对FL4b-rNS3解旋酶活性起到一定的抑制作 用(P=0.003),使解旋活性降低大约50%,而对照抗体则不具有抑制性(P=0.239)。由此可以推测出,mAb2E12可能起到HCVS旋酶抑制剂的作用,进而有可能影响到HCV病毒复制。但是由于FL4b-rNS3蛋白不能达到相对高的纯度,使蛋白污 染了少量的宿主细胞的解旋酶。这种污染会对双链DNA起到一定的解旋作用,产生单链DNA释放荧光,干扰 体外抑制试验结果。为了避免其他解旋酶的污染,精确验证mAb2El2勺抑制功能, 我们将在下一步的实验研究中进行细胞内的解旋酶功能实验 , 即把重组 mAb2E12 的病毒载体转染到稳定复制HCV勺H