A549细胞培养

1、A549 细胞的培养A549 细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1: 21: 3传代培养都是可行的。所需溶液 1 ， 细胞冲洗液:磷酸盐缓冲液 (PBS) 无Ca、MgNACLKCLKH2PO4Na2HPO4 .。 1 2H2O加水至1 OOOmL将PH调至，高压灭菌。2，消化液1 ) 胰 酶 -PBS结晶胰酶高压灭菌后的 PBS1OOOml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过口的滤膜过滤除菌，分装备用，放置一20C保存。2)胰酶 EDTA:结晶胰酶1 000mlEDTA盐溶液无 Ca、Mg PBS用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，

2、通过口的滤膜过滤除菌，分装备用，放置一20C保存。3，细胞培养液： RPMI 1640培养液配制方法：将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。加入丙酮酸钠 ， NaHCO2 2g 以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁 力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入。调整培养液的PH值，用PH精密试纸观察PH 4即可。am滤膜,过滤法除菌，所使用的滤器为O 2加压过

3、滤，0 .2 2滤膜事先采用高压灭菌消毒。分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置20C保存。细胞的维持和培养细胞的复苏(1)准备一个盛有3 7C温水的烧杯，从液氮罐中取出存有A5 4 9细胞的冻存管，放于3 7C温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。2)10002 000 r， 35 min 离心。在无菌操作台中采用 75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。(4)用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将 细胞吹散开，转移至25cm无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 向已经长满的细胞中加入消化液 1ml，轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃

4、或倒掉，轻轻冲洗细胞表 面23遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。培养瓶中。(5)补充4ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。(6)倒置显微镜下观察，37C、5%CQ培养。(7)24h后，更换新的培养液。(8)常规传代培养。2,A549细胞更换新的培养液(1)无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。(2)用PBS反复冲洗细胞23遍。(3)加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。各种液体需要量(ml)表面积25cm275cm2150cm2洗涤3510胰酶121325培养液51020(4)倒置显微镜下观察，37C、5%CQ培养。3,A549细胞的传代加入1ml消化液，在37C培

5、养箱中孵育58 min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质 增大后，立即终止消化。(4) 加入5ml预热至37C的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一 边结束，以确保所有的底部都被吹到。吸取一半的细胞悬液，接种到新的 25cm2 培养瓶中，补足培养液，并且添加 10% 20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为 5 10ml。(6)倒置显微镜下观察，37C、5%CQ培养。注意事项 ：(1)所有液体在加入细胞瓶前均应预热到 37C。所有液体均应调整PH至左右，均不能超过。2) 细胞消化传代时吹打不要产生气泡,吹打力量不宜过多,否则会损伤细胞。严格执行无菌操作的要求。4) 尽可能减少消化液剩余量,过多时会对细胞产生损伤,可多添加些含牛血清的培养液中和。(5)培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。4,A549细胞的冻存(1)消化已生长融合的单层细胞。(2)用生长液悬浮细胞，并