细胞生物学实验Hela细胞培养

1、Hela细胞培养及相关生理指标检测 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞培养的基本概念 传代培养传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器 皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细 胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增 3-6次。 原代培养原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称 为原代培养。一旦进行传代培养，便不再是原代培养，而改称为细 胞系。 细胞培养细胞培养培养单个细胞悬液 组织培养组织培养培养组织块（0.51 mm3）或薄片（0.2 mm3 ） 器官培养器官培养 培养一部分或整个器官 细胞生物学实验H

2、ela细胞培养 人平滑膜细胞培养24h后贴壁生长，平 滑膜组织中主要有两种细胞：成纤维 细胞样形态呈树枝状贴壁生长；巨噬 样平滑膜细胞为单核/巨噬样细胞形 态，分裂增殖较慢（箭头处） 原代培养的新生大鼠心肌细胞，细胞 形态以梭性、多角形为主 细胞生物学实验Hela细胞培养 原代培养细胞的培养周期 原代培养期 传代培养期 衰退期 初代 培养 有限细胞系 无限细胞系 接种培养 第 一 次 传 代 老化 死亡 转化 传代 间隔 指 数 细 胞 数 量 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 16周 指 数 细 胞 数 量 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞系

3、（cell line）： 原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有 限细胞系（finite cell line）；已获无限繁殖能力可以持续生存的细胞系，称为连续细 胞系或无限细胞系（infinite cell line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核 型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只 有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性， 异体接种还有致瘤性 。 细胞株（cell strain/stable cell line）： 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质

4、或标志物称 为细胞株。细胞株的特殊性质或标志物必须在整个培养期间始终存在。由原细胞株进 一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（substrain）。 细胞株的 遗传物质没有发生变化，但是不能无限传代。 克隆（clone）： 亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有 丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（mass culture），将含 有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，细胞贴壁生长形成均匀的单细胞 层或者悬浮生长；另一种是克隆培养（clonal culture），将高度稀释的

5、 游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生 长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克 隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 细胞生物学实验Hela细胞培养 培养细胞的特性 培养细胞的生长方式： 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种 造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程： 游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期） 细胞生物学实验Hela细胞培养 THP-1细胞（人单核巨噬细 胞），圆形，悬浮生长 HepG2（人肝癌细胞）细胞， 梭形，

6、贴壁生长 细胞生物学实验Hela细胞培养 游离期： 细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回 缩，胞体呈圆球形。10分钟5小时。 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在10分钟5小时 内贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长 基质），这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细 胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。 高级培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞贴壁的基本过程 细胞生物学实验Hela细胞培养 潜伏期： 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏

7、期 一般为624小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行 实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 细胞生物学实验Hela细胞培养 新传代的NRK细胞（大鼠肾细胞） 传代后24小时 对数生长期的NRK细胞 传代后三天 早平台期的NRK细胞 传代后7天 细胞生物学实验Hela细胞培养 潜伏期 指数增生期 平台期 有限细胞系 无限细胞系 接种培养 细胞数/毫升 106 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 104 105 天 贴附生长细胞的生长过程 细胞生物学实验Hela细胞培养 培养细

8、胞生长的条件 细胞的营养需要：特定的培养基和添加剂 细胞的生存环境： 温度: 37 ； CO2 、O2 ； pH: 7.2-7.4；渗透压；适宜的湿度 无化学和生物污染、无毒害 CO2: 5% 10 缓冲体系： CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- HEPES 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞培养所需要的耗材和仪器 生物安全柜（超净工作台），高压灭菌锅，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱，光学显微镜 -80超低温冰箱，液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，移液管，电动移液器，培养皿，冻存管 高压灭菌锅：湿热消毒 电热干燥箱：干热消毒 滤器：过滤除菌，大多数培养用

9、液，包括人工合成培养基、血清、酶 液等均采用0.22 m滤膜过滤除菌 生物安全柜：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯：紫外线消毒。 主要用于操作台、塑料培养皿等表面消毒 细胞生物学实验Hela细胞培养 CLASS II CLASS III 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞生物学实验Hela细胞培养 添加剂：添加剂： 1、HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液，缓冲区间为pH 7.2 - 7.4 。在开放式细胞培养时能维持较恒定的PH值。高浓度时对一些细胞可能有毒， 工作浓度为10 mM。 2、NaHCO3-CO2，作为常用的缓冲系统，如果培养箱中

10、CO2浓度设定为5，则 NaHCO3的工作浓度为2.0g/L；如果CO2浓度设定为10，培养基中NaHCO3的工作 浓度为3.7g/L。 3、酚红：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。酚红在无血清培养基时 可能带来细胞内外钠/钾失衡，影响细胞生长，这种作用在有血清培养时能被血清 中和或减轻。 细胞培养所需要的溶液 细胞生物学实验Hela细胞培养 添加剂：添加剂： 4、L-谷氨酰胺：脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白 质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在4度溶液中存放时间过长会降解，通常培养基 一个月内没有用完，需要补充相同量的L-谷氨酰胺再继续使用。 5、丙酮酸钠：

11、丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，细胞一般倾向于以葡萄 糖作为碳源，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以利用丙酮酸钠作为碳源。 6、EDTA：二价离子会抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合溶液中游离的镁离子和 钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。 细胞培养所需要的溶液 细胞生物学实验Hela细胞培养 消化液：消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘 蛋白及糖蛋白，影响细胞之间以及细胞和底物的粘连，从而使细胞 分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca、Mg离子的PBS缓冲液配 制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25，0

12、.22 m滤膜过滤除菌 。 胰蛋白酶液消化时间：细胞种类不同消化时间也不一样，一般 是1-10分钟。 含血清的培养基可以终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。 细胞培养所需要的溶液 细胞生物学实验Hela细胞培养 培养基培养基 培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，包括天然培养基和合成 培养基。 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好。 缺点：来源受限，成分复杂，存在批次的差异，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，容易发生支原体污染。 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模 拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、

13、MEM、RPMI- 1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其 它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 细胞生物学实验Hela细胞培养 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补 充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白和转移蛋白等）； 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 各种生长因子； 不明成分； 一般说来，含5血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死， 但支持细胞生长一般需要10

14、的血清。对于血清支持细胞生长的生物 学效应已得到证明，但血清中的复杂成分至今尚未完全研究清楚。血 清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长的抑制因子或毒 性因子，因此含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞 和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调 控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。 细胞生物学实验Hela细胞培养 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子， 如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多

15、 年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无 血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性， 减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 向无血清培养基中补充的能促进细胞系生长的添加物都是独特的。适 用于某种细胞株的培养基，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前绝大多数人工合成培 养基使用时还需添加血清。 多数的干细胞需要特殊的没有血清的培养基，以保持未分化状态。 细胞生物学实验Hela细胞培养 血清质量好坏是细胞培养的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清

16、、兔血清、马血清等， 其中以胎牛血清质量最好。血清存在明显的批次差异，通常是对各个批次的血清进 行试用后再采购效果最佳批次的血清。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 非胎牛血清需要灭活以减少补体和支原体的影响：56 ，30分钟。 一般的血清出厂时都经过严格的检测，不会存在污染。血清在长时间的存放后一般 会出现絮状沉淀等不溶物质，不会影响正常的使用，除非经过试用发现存在污染， 需要根据污染的种类酌情处理，如果对血清过滤除菌，因为滤膜会过滤掉很多血清 的有效成分，所以必须在过滤后提高血清的工作浓度。 在培养基配制后，培养基内需要添加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌

17、的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升 100单位。为了更好的避免抗生素和轻微污染对细胞状态及实验结果的影响，操作熟 练时可以不加抗生素培养细胞。 培养基配制后，还需要添加一些氨基酸，包括L-Glutamin、NEAA（非必需氨基酸） 和丙酮酸钠等，最终使用浓度为每毫升100单位。 细胞生物学实验Hela细胞培养 化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些 污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等. 化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡 后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料

18、等疏水性强的物质有很 强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对 细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即 注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞 因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。 生物污染包括细菌、真菌、支原体、病毒和非同种细胞污染，这些污 染源能在合适的环境中非常快速的生长。生物污染除病毒和支原体污染外 都比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养基产生可见的变化，或者 通过显微镜可以观察到。由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比 较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的

19、实验室都 没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个 细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细 胞的实验结果。 细胞培养中的污染 细胞生物学实验Hela细胞培养 1、细菌污染 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养基中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培 养细胞受细菌污染后，会出现培养基变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱 落死亡。 细胞培养中的污染 细胞生物学实验Hela细胞培养 2、真

20、菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵 母菌。 培养细胞受真菌污染后，可见培养基中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养基一般不发生混浊；倒 置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 细胞培养中的污染 细胞生物学实验Hela细胞培养 3、支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2 m，约有1%可通过细胞滤器（滤器孔径 0.22 m ），光镜下难以看清它的形态结构。开始不易

21、发现，能在偏碱条件（PH7.6-8.0）下生存，对酸耐受性差。对热 比较敏感，对青霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。支原体污染细胞后，培养基可不发生混浊。多 数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此易被忽视。但个别严重者，可致细 胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。 细胞培养中的污染 细胞生物学实验Hela细胞培养 4、病毒污染 组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养 中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫 苗、干扰素等

22、生物制品制作中的难题。 5、非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。 目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而 带入一些有毒化学物质所致。 细胞培养中的污染 细胞生物学实验Hela细胞培养 1、细菌、真菌污染的检测、细菌、真菌污染的检测 （1）肉眼观察 细菌和真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明 显观察到（过滤培养基通常是以48小时内观察不到污染为标准），

23、例如培养基变混浊，或略加振荡有很多漂浮物 漂起。 （2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养基中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。 细胞之间有丝状、管状、树 枝状或卵形的物质常为真菌污染。 2、支原体污染的检测、支原体污染的检测 （1）相差显微镜观察 直接取少许培养基滴在载物片上，再加上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间， 有时可见类似于布朗运动的表现。 应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。 （2）荧光染色法观察 用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈 绿色小点，散在于细胞周围或附于

24、细胞表面。 3 、病毒的检测、病毒的检测 （1）应用电镜技术快速诊断动物病毒。 （2）逆转录聚合酶链反应RT-PCR检测病毒。 细胞污染的检测 细胞生物学实验Hela细胞培养 若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。 一、细菌和真菌的清除 1、使用抗生素 抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 预防用药一般用双 抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养基。此法 在污染早期有效。 二、支原体的清除 、用MRA等药物直接处理 用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处

25、理细胞，每4天换一次液，连续处理15天以确保细胞纯洁健康。 2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法 细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤 其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵 支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限，如结合敏 感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 3、药物辅助加温处理 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在40培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 细胞污染的清除 细胞生物学实验Hela细胞培养 1、试剂、耗材、器材消毒灭菌 细胞培养所用物品清

26、洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴 性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。 2、操作过程 穿着容易起静电或容易吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。 进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始 要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查器材、溶液和细胞，不要把污染品 或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。 细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作 时把隔板尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽绝对不能对着工作区。 操作时要常更换巴斯德吸管、枪头和移液管

27、，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了 手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75酒 精清洁台面。 3、防止细胞交叉污染 在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按 顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。 在进行换液或传代操作时，粘有细胞的枪头和移液管不要触及培养基瓶瓶口，以免 把细胞带到培养基中污染其他细胞。 所有细胞一旦购置、或从别处引入、或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污 染可弃之复苏，重新培养。 细胞污染的预防 细胞生物学实验Hela细胞培养 1、第一次开始培养某种细胞、第一次开始培养某种细胞 不管师兄师姐怎么介绍该细胞

28、的培养方法，第一次开始培养某种细胞时，一定要去 用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该种细胞的详细信息，包括需要使用的培 养基、血清、添加剂，通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培 养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。 2、进入细胞间开始细胞培养时、进入细胞间开始细胞培养时 确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和 耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。 确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。 确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行 消毒。 确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行

29、补充。 确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。 细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口在火焰周围简 单转动烧灼（过分烧灼会把瓶口烧坏）。 瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。 尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请 用喷过75乙醇的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。 不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。 确定工作台的隔板已经放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽绝对不能对着工作区。 操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净，必须及时更换。 实验完毕及时收拾，保持工作

30、区域清洁整齐，最后用75酒精清洁台面。 细胞培养操作的注意事项 细胞生物学实验Hela细胞培养 电动移液辅助器的使用规范 装载移液管时需要把刻度朝向自己，以更好衡量体积。 为了避免污染或者损坏电机，吸液不要超过移液管的警戒线，如果液体超过警戒线必须立即停止吸液，丢弃 移液管，拆开移液管固定卡口检查液体是否进入滤器，如果液体已经通过滤器进入内部线路，必须及时送修， 以免电机报废。 贴壁不紧的细胞，可以调到低档吹打细胞，贴壁紧的细胞可以调到高档进行吹打，发现吹打力量低时先检查 档位是否在低档，如果不是就需要及时更换电池。另外为了避免产生气泡，吹打细胞时不要把液体吹完。 最最 高高 移移 液液 体体

31、 积积 细胞生物学实验Hela细胞培养 正向吸液：吸液时，将移液器按钮按到第一档吸液，释放按钮。吹液时， 先按到第一档，打出大部分液体，再按下第二档， 将余液排出。 气体活塞式移液器的使用规范 细胞生物学实验Hela细胞培养 预润湿吸液 ：易挥发或粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来实现精确 移液。操作时，先吸入液体，打出，吸头内壁会吸附一层液体。连续预 吸35次，使吸头内壁吸附达到饱和，再吸入液体，再打出，所移取的 液体体积会很精确。 反向吸液：通常与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发 液体。吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体， 打出液体时只要按到第一档即可。此

32、时，吸头内部还有多余液体，可以 补偿吸头内部的表面吸附。 细胞生物学实验Hela细胞培养 第一步第一步 、设定移液体积（可调量程、设定移液体积（可调量程 移液器）移液器） 旋转移液器上端旋钮进行体积调节。1,000l 以下 量程的移液器以l为单位显示体积，5ml 和10ml 量程的移液器体积以ml为单位显示体积。从大体 积调节至小体积时，逆时针旋转至刻度即可；从 小体积调节至大体积时，可先顺时针调过设定体 积，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。 第二步第二步 、装配移液吸头、装配移液吸头 对于单道移液器，将移液器末端垂直插入吸头， 轻压固定紧即可； 对于多道移液器，将移液器的第一道对准第一

33、个 吸头，倾斜插入，前后稍许摇动上紧即可。 第三步第三步 吸液和吹液吸液和吹液 垂直吸液， 吸头尖端需浸入液面 3 mm 以下 选择正确的移液方式慢吸慢放，控制好弹簧的伸 缩速度，吹放液时吸头尖端靠在容器内壁 。 5ml和10ml的移液器要配合滤芯吸 头或过滤器使用，吸液时，吸头 需浸入液面以下5mm，慢吸液体， 达到预定体积后，在液面下停顿3 秒后再离开液面。 细胞生物学实验Hela细胞培养 装配吸头时用移液器反复撞击吸头插入吸头 轻压即可上紧吸头轻压即可上紧吸头 吸头与移液器不匹配，影响气密性 选用与移液器匹配的、有质量保证的吸头选用与移液器匹配的、有质量保证的吸头 吸液时，移液器倾斜 吸

34、液垂直吸液吸液垂直吸液 吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面 将移液器垂直挂在移液器支架上将移液器垂直挂在移液器支架上 用大量程的移液器移取小体积的液体 移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内 吸取具有强挥发性的液体 如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让 蒸汽挥发。蒸汽挥发。 吸液速度和吹液速度过快 慢吸慢放慢吸慢放 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞生物学实验Hela细胞培养 冻存和复苏 细胞的低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代 保

35、存相比可以减少人力、物力和财力，减少污染，减少细胞的生物学 特性衰减或者变异，细胞冻存与复苏的原则是慢冻快融。 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中 可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶； 相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏 过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低 温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高 胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻 结前透出细胞外，在胞外形成

36、冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对 细胞的损伤。 细胞生物学实验Hela细胞培养 细胞传代方法 悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：1000RPM离心，吸去上清，细胞沉淀用新鲜培养基 重悬后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在培养瓶壁时，将上清培养基去除1/2 2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液后再传代。 半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使 细胞从培养瓶壁脱落下来，形成细胞悬液后再传代。 贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液为0.25的胰蛋白酶液。 细胞生物学实验Hela细胞培养 台盼蓝

37、法： 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞 活力。 四唑盐（MTT）比色法： 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物Formazan，并 沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在 细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比。再用酶标 仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试 验、肿瘤放射敏感性实验等。 细胞克隆形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的 克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率克隆形成数接种细胞数 培养细胞活力测定 细胞生

38、物学实验Hela细胞培养 培养细胞活力测定 CCK-8法： CCK-8试剂中含有WST8,2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二 磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯 （1-methoxy pms）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶 性的黄色甲臜产物（formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正 比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞 数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤 药物筛选、细胞增殖实验、细胞毒性实验以及药敏实验等。 CCK-

39、8法优点： 1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2、检测快速、灵敏度高，可以测定较低细胞密度； 4、重复性优于MTT法，对细胞毒性小； CCK-8法缺点： 贵 细胞生物学实验Hela细胞培养 Hela细胞培养及相关生理指标检测 实验目的： 了解并掌握细胞传代培养的相关原理 了解并掌握细胞活力测定和生长曲线绘制的原理和方法 实验器材： 二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、 离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、Hela细胞（人宫颈癌细 胞）、细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、 0.25胰蛋白酶（

40、含0.02的EDTA）、PBS等。 细胞生物学实验Hela细胞培养 Hela细胞消化实验步骤 做好细胞操作前的准备工作（所有器具用紫外照射30分钟；右撇子的同 学把所有试剂放在右手位并把瓶盖稍微旋松；细胞放在左手位；戴上手 套并用75%酒精消毒；检查酒精灯里的酒精是否达标） 用移液器把培养基（DMEM）吸走（注意不要吸的太干，并避免细胞长 时间脱水）。 用1毫升胰酶（Trypsin）或者PBS润洗细胞一到两遍以去除残留的血清 （血清可以抑制胰酶消化）。 再次加入胰酶对细胞进行消化（Hela细胞一般消化两分钟）。 消化结束后加入含有血清的培养基以终止胰酶的消化作用。 长有细胞的培养器皿底部是不透明的，对着灯光可以看到随着消化的进行， 会有部分区域变得透明，不透明的细胞层会脱落并且漂浮在培养器皿中。 如果在显微镜下观察可以发现贴壁细胞会逐步变圆并从培养器皿底部脱离， 浮在溶液中。 如果需要传代细胞，