山西大学关于酶标仪的使用方法

1、 一、一、ELISA法介绍法介绍 二、酶标仪和多功能酶标仪二、酶标仪和多功能酶标仪 三、仪器操作三、仪器操作 经典的化学分析方法（如滴定分析、重量分析、经典的化学分析方法（如滴定分析、重量分析、 分光光度法）能对化学体系组分进行常量或微量分光光度法）能对化学体系组分进行常量或微量 分析，而对复杂生物体系的微量成分的测定往往分析，而对复杂生物体系的微量成分的测定往往 力不从心。力不从心。 在此背景下，科学家研发了一系列测定生物体系在此背景下，科学家研发了一系列测定生物体系 成分含量的方法，其中免疫化学法（如酶联免疫成分含量的方法，其中免疫化学法（如酶联免疫 法、免疫荧光法、放射免疫法）因具有高特

2、异性、法、免疫荧光法、放射免疫法）因具有高特异性、 超微量分析生物体有机成分的特点而得到迅速推超微量分析生物体有机成分的特点而得到迅速推 广和发展。广和发展。 1971年人们建立了用年人们建立了用酶来标记抗原或抗酶来标记抗原或抗 体体的分析技术，使得原来极其微乎其微的的分析技术，使得原来极其微乎其微的 抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来， 并进行定量，这种技术被称为酶联免疫吸并进行定量，这种技术被称为酶联免疫吸 附试验法，简称附试验法，简称ELISA。 （Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay） 酶联免疫法的专用仪器就是酶标仪。

3、酶联免疫法的专用仪器就是酶标仪。 酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服 从朗伯比尔定律。物质的含量与显色液的从朗伯比尔定律。物质的含量与显色液的 颜色深浅成正比，而颜色深浅可用吸光度颜色深浅成正比，而颜色深浅可用吸光度 表示，所以物质的含量与吸光度值成正比。表示，所以物质的含量与吸光度值成正比。 酶标记抗原或者抗体发生免疫学反应后，酶标记抗原或者抗体发生免疫学反应后， 与底物的结合物，在特定波长下有最大吸与底物的结合物，在特定波长下有最大吸 收，可通过测定显色液的吸光度对待测物收，可通过测定显色液的吸光度对待测物 进行定量。进行定量。 1.免疫学知识免疫学知

4、识 2.常用的常用的ELISA分析分析 3.ELISA 应用应用 什么是抗体？什么是抗体？ 什么是抗原？什么是抗原？ 什么是抗原抗体反应？什么是抗原抗体反应？ 抗体是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种抗体是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种 能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白 ( (Immunoglobulin, Ig) )。 人类免疫球蛋白有五类，即人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgA、IgM、IgD 和和IgE。 含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。 免疫球蛋白（免疫球蛋白（Ig）是机体受抗原刺激后是机体受

5、抗原刺激后 产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应， 生成抗原生成抗原- -抗体复合物。可以阻断病原体对抗体复合物。可以阻断病原体对 机体的危害，也可以引起过敏反应或其他机体的危害，也可以引起过敏反应或其他 有害反应。有害反应。 什么是抗原什么是抗原 ？ 各种抗原物质的化学组成虽然很复杂，各种抗原物质的化学组成虽然很复杂， 但能刺激机体产生抗体并与抗体反应相但能刺激机体产生抗体并与抗体反应相 结合的化学组成，仅仅是抗原物质表面结合的化学组成，仅仅是抗原物质表面 的一些具有活性的化学基团、化学结构的一些具有活性的化学基团、化学结构 及空间构型，被称为抗原物质决

6、定簇及空间构型，被称为抗原物质决定簇。 分子结构的差异性，决定各种物质抗分子结构的差异性，决定各种物质抗 原的特异性。原的特异性。 抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。 在体内进行的抗原抗体反应称为免疫反在体内进行的抗原抗体反应称为免疫反 应，在体外进行的抗原抗体反应称为血应，在体外进行的抗原抗体反应称为血 清学反应。清学反应。 没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；没有抗原的刺激，机体不能产生抗体； 利用抗体可以检测抗原物质。利用抗体可以检测抗原物质。 ELISA法是建立在抗原与抗体免疫学反应的法是建立在抗原与抗体免疫学反应的 基础上，因而，具有特异性。基础上，因

7、而，具有特异性。 由于测定中需要酶标记抗原或抗体，酶分由于测定中需要酶标记抗原或抗体，酶分 子与抗原或抗体分子的结合物可以催化底子与抗原或抗体分子的结合物可以催化底 物分子发生反应，产生放大作用，正因为物分子发生反应，产生放大作用，正因为 此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。 1).测定抗原测定抗原 2).测定抗体测定抗体 A 将抗体吸附于固相表面，这个过程叫包被。将抗体吸附于固相表面，这个过程叫包被。 B 加抗原，形成抗原加抗原，形成抗原-抗体复合物。抗体复合物。 C 加酶标抗体。加酶标抗体。 D 加酶反应的底物。反应终止时，反应液的颜加酶反应的底物。

8、反应终止时，反应液的颜 色深浅与抗原的含量成正比。色深浅与抗原的含量成正比。 1.包被抗体的酶标板（一抗）。包被抗体的酶标板（一抗）。 2.加待测抗原。抗原抗体反应，洗涤。加待测抗原。抗原抗体反应，洗涤。 3.加酶标抗体（二抗）。反应，洗涤。加酶标抗体（二抗）。反应，洗涤。 4.加显色底物（三抗），反应，洗涤。加显色底物（三抗），反应，洗涤。 5.加终止液。加终止液。 6.酶标仪上读取吸光度值。酶标仪上读取吸光度值。 7.根据标准曲线对待测抗原进行定量。根据标准曲线对待测抗原进行定量。 A 抗原包被在酶标板。抗原包被在酶标板。 B 加抗体，形成抗原抗体复合物。加抗体，形成抗原抗体复合物。 C

9、加酶标抗体（一抗）加酶标抗体（一抗） D 加酶底物（二抗），显色，比色。加酶底物（二抗），显色，比色。 原则上原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体可用于检测一切抗原、抗体 及半抗原，可以直接定量测定体液中的可及半抗原，可以直接定量测定体液中的可 溶性抗原。溶性抗原。 在实际应用中它和医学、生物化学、免疫在实际应用中它和医学、生物化学、免疫 学、微生物学、药理学、环境学等方面密学、微生物学、药理学、环境学等方面密 切相关。切相关。 医学方面：肿瘤研究中检测甲胎蛋白；检医学方面：肿瘤研究中检测甲胎蛋白；检 测过敏原；检测血清中白蛋白及免疫球蛋测过敏原；检测血清中白蛋白及免疫球蛋 白；传染病诊断

10、中检查乙型肝炎表面抗原。白；传染病诊断中检查乙型肝炎表面抗原。 环境科学方面：测定污染物抗原干预下生环境科学方面：测定污染物抗原干预下生 长因子、细胞因子、酶的变化。长因子、细胞因子、酶的变化。 其他：植物组织浆液中检查植物病毒；普其他：植物组织浆液中检查植物病毒；普 通比色分析。通比色分析。 普通酶标仪普通酶标仪 多功能酶标仪多功能酶标仪 No Image 比色装置：比色装置： 聚苯乙烯塑料微孔板：聚苯乙烯塑料微孔板：96孔孔 光电检测器光电检测器 波长：波长：4-6个个 比色装置：酶标板，非比色杯比色装置：酶标板，非比色杯 光路：垂直光路：垂直 功能：不能波长扫描；只在固定波长的可功能：不

11、能波长扫描；只在固定波长的可 见光范围测定；可对化学物及生命组分进见光范围测定；可对化学物及生命组分进 行终点分析。行终点分析。 普通酶标仪基本功能有普通酶标仪基本功能有2个：个： （1）相当于分光光度计：测定化合物含量）相当于分光光度计：测定化合物含量 或者细胞存活率等。或者细胞存活率等。 （2）基于免疫反应的）基于免疫反应的ELISA分析。分析。 新型的多功能酶标仪价格在新型的多功能酶标仪价格在20-50万元，分万元，分 析功能得到广泛拓展，这对酶标仪的应用析功能得到广泛拓展，这对酶标仪的应用 有深刻的意义。有深刻的意义。 世界卫生组织专家组提出对世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认

12、为：的评价认为： “ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要作为免疫诊断应用是一个好办法，但要 做好它不容易。做好它不容易。” 1.对对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完善，法的非特异性评价的资料尚不够完善， 因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往 不易解释。不易解释。 2.固相载体的质量常不统一，主要是原料及制固相载体的质量常不统一，主要是原料及制 备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有 时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验 结果。结果。 3.试剂不统一，

13、现在处于试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神八仙过海，各显神 通通”，标准还不能统一。，标准还不能统一。 1.比色杯或者微孔板（比色杯或者微孔板（6 6、1212、2424、4848、9696 和和384384孔微孔板孔微孔板 ）, ,测样量大测样量大 ； 2. 200-1000 nm ，有紫外可见光、荧光、偏，有紫外可见光、荧光、偏 振光等振光等,波长变化可达到波长变化可达到1nm, 只要是有色溶只要是有色溶 液即可测定吸光度；液即可测定吸光度； 3.可提供终点检测、动力学、单孔扫描和光可提供终点检测、动力学、单孔扫描和光 谱扫描等测读模式谱扫描等测读模式 ； 4.分析功能扩大。分析功能扩

14、大。 DNA/RNA定量和纯度检测定量和纯度检测 Bradford /Lowry实验实验 细胞活性细胞活性/细胞毒性检测细胞毒性检测 MTT分析分析 （IC50/LD50 ） 细菌生长分析细菌生长分析 钙流检测钙流检测 膜电位检测膜电位检测 双荧光素酶报告基因分析双荧光素酶报告基因分析 ATP检测检测 微生物生长微生物生长 绿荧光蛋白分析绿荧光蛋白分析 药代毒性分析药代毒性分析 膜渗透分析膜渗透分析 荧光偏振分析荧光偏振分析 三、酶标仪操作三、酶标仪操作 1. 注意事项注意事项 2. 酶标板酶标板 3. 操作要点操作要点 1.注意事项 1）反复研读试剂盒说明，熟悉操作步骤。）反复研读试剂盒说明

15、，熟悉操作步骤。 2）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终 止的加量准确，最好使用加样枪加液以保止的加量准确，最好使用加样枪加液以保 证比色时吸光度的准确性。枪头不要混用。证比色时吸光度的准确性。枪头不要混用。 3）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗 涤涤5次，切要把残液甩干。次，切要把残液甩干。 4）观察和判读吸光度结果应在）观察和判读吸光度结果应在15min 内完成，内完成， 否则液体颜色会减退。否则液体颜色会减退。 5）待测生物样品要放在）待测生物样品要放在4冰浴上。冰浴上。 6）显色液要现用现配，避光低温保存

16、）显色液要现用现配，避光低温保存 。 7）注意购买抗体的保存。）注意购买抗体的保存。 2.2.酶标板酶标板 酶标板材料酶标板材料 可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成 为不溶形式，这是进行酶标记测定的基为不溶形式，这是进行酶标记测定的基 本条件。许多物质可作为固相载体，如本条件。许多物质可作为固相载体，如 纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚 丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等 等。但在等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或中最常用的是聚苯乙烯或 聚氯乙烯微量反应板。由于微量反应板聚氯乙烯微量反

17、应板。由于微量反应板 所用试剂量少，操作方便，适合于大规所用试剂量少，操作方便，适合于大规 模应用。模应用。 酶标板材料酶标板材料 国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三 厂出品）目前已大量应用于厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，测定， 并且获得了满意的结果。但每批微量反并且获得了满意的结果。但每批微量反 应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是 有显著差别的。实验证明，吸附效果似有显著差别的。实验证明，吸附效果似 乎与塑料的类型及其表面性质有关。特乎与塑料的类型及其表面性质有关。特 别是塑料制品在加工过程中因工艺不同别是塑料制品

18、在加工过程中因工艺不同 或受其他因素的影响而造成吸附性能的或受其他因素的影响而造成吸附性能的 极大差异，甚至完全丧失吸附能力。极大差异，甚至完全丧失吸附能力。 酶标板鉴定酶标板鉴定 对每批制品在使用前，必须经过实验室对每批制品在使用前，必须经过实验室 鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的 微量反应板抽样，用检测试剂盒进行试验，微量反应板抽样，用检测试剂盒进行试验， 当显色并终止反应后，在酶标比色计中测当显色并终止反应后，在酶标比色计中测 定其定其O.D值。值。 一般认为全板中每两孔间一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不超值的误差不超 过过10%为合格。如果

19、中间孔与四周孔为合格。如果中间孔与四周孔O.D值值 相差太大，或者反应板的这一边与另一边相差太大，或者反应板的这一边与另一边 凹孔的凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，还值相差大，均不合格。此外，还 要检查阳性和阴性参考血清要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明值是否有明 显差别。一般要求有显差别。一般要求有10倍左右的差异为合倍左右的差异为合 格。格。 酶标仪单、双波长检测酶标仪单、双波长检测 一般的酶标仪在测定中均有单波长和双一般的酶标仪在测定中均有单波长和双 波长的模式，为什么呢？波长的模式，为什么呢？ 酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是否酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是否 水平、

20、酶标板透光性、孔底是否平整等的水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的 影响较大。影响较大。 选择选择 630nm为参比波长为参比波长, 测定其吸光度测定其吸光度A0;在在 测定波长（如测定波长（如490nm/450nm）下测定样本）下测定样本 的吸光度的吸光度A,双波长测定后双波长测定后,取二者的差值取二者的差值, 测测 定结果的标准偏差比单波长下测定的要小定结果的标准偏差比单波长下测定的要小, 实验误差小。实验误差小。 在在ELISA测定所使用的底物如邻苯二胺或测定所使用的底物如邻苯二胺或 四甲基联苯胺，显色终止后，在四甲基联苯胺，显色终止后，在 630nm 处 的 吸 光 度 值 都 只 有

21、 吸 收 峰 处处 的 吸 光 度 值 都 只 有 吸 收 峰 处 （490nm/450nm）吸光度值的）吸光度值的1%以下，以下， 因此，利用双波长检测，不会影响检测因此，利用双波长检测，不会影响检测 灵敏度。灵敏度。 一般酶标仪比色应该首选双波长。一般酶标仪比色应该首选双波长。 酶标仪的工作环境酶标仪的工作环境 1.仪器应放置在无强磁场和干扰电压的位置。仪器应放置在无强磁场和干扰电压的位置。 2.仪器应放置在噪音低于仪器应放置在噪音低于40分贝的环境下。分贝的环境下。 3.为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。 4.操作环境温度应在操作环境温度应在15

22、40之间，环境湿度在之间，环境湿度在 15%85%之间。之间。 5.操作时电压应保持稳定。操作时电压应保持稳定。 6.操作环境空气清洁，避免水汽、烟尘。操作环境空气清洁，避免水汽、烟尘。 7.保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够 的操作空间。的操作空间。 3.Bio-Rad Model 550酶标仪操作酶标仪操作 1.接通电源，打开酶标仪开关。接通电源，打开酶标仪开关。 2.仪器开始自检。仪器开始自检。Self disgonsis in progress 3.按箭头光标到按箭头光标到Mode,设置参数。当仪器出设置参数。当仪器出 现现set analysis mode 时，按时，按enter确定。确定。 4.选择测定波长的类型。按箭头光标到选择测定波长的类型。按箭头光标到 D/S,按按select选中，选中，enter 确定。光标出现确定。光标出现 在在Dual/Single，选择双波长，按，选择双波长，按select 选中，选中，enter 确定。确定。 5.选择滤光波长，此酶标仪有四个波长：选择滤光波长，此酶标仪有四个波长：1： 405nm;2: