生物微生物的纯培养和显微性技术

1、微生物的纯培养和微生物的纯培养和 显微技术显微技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 第四章第四章 微生物的纯培养和显微技术微生物的纯培养和显微技术 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 显微镜和显微技术显微镜和显微技术 n显微镜下的微生物显微镜下的微生物 生物微生物的纯培养和显微性技术 培养物培养物 纯培养物纯培养物 混合培养物混合培养物 纯培养能较好地得到重复结果纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一是微生物研究的重要技术之一 培养物（培养物（culture）：在微生物学中，在人为规定）：在微生物学中，在人为规定 的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。的条件下培养、繁殖

2、得到的微生物群体。 纯培养物（纯培养物（pure culture）：只有一种微生物的）：只有一种微生物的 培养物。培养物。 生物微生物的纯培养和显微性技术 显微技术是微生物研究的另一项重要技术显微技术是微生物研究的另一项重要技术 个体小个体小 生物微生物的纯培养和显微性技术 1. 无菌技术无菌技术 2. 用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养 3. 用液体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养 4. 单细胞（孢子）分离单细胞（孢子）分离 5. 选择培养分离选择培养分离 6. 二元培养物二元培养物 生物微生物的纯培养和显微性技术 无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它无菌技术：

3、在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它 微生物污染的技术。微生物污染的技术。 它是保证微生物学研究正常进行的关键它是保证微生物学研究正常进行的关键 1.1 微生物培养的常用器具及其灭菌微生物培养的常用器具及其灭菌 1.2 接种操作接种操作 生物微生物的纯培养和显微性技术 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿都要常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿都要 灭菌灭菌 培养基：供微生物、植物和动物组织生长和维培养基：供微生物、植物和动物组织生长和维 持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合 物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及物、含氮物质、无机盐（包括微量

4、元素）以及 维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色 素，用于单种微生物培养和鉴定。素，用于单种微生物培养和鉴定。 一、无菌技术一、无菌技术第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 1. 干热灭菌：一般玻璃用具，如培养皿、吸管等干热灭菌：一般玻璃用具，如培养皿、吸管等 用报纸包好后，放烘箱中，使温度逐渐升至用报纸包好后，放烘箱中，使温度逐渐升至150 160，保持，保持2小时后，关闭电源，使缓慢小时后，关闭电源，使缓慢 冷却（降温太快时玻璃易碎），即灭菌完毕。冷却（降温太快时玻璃易碎），即灭菌完毕。 一、无菌

5、技术一、无菌技术第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 常压法（间歇灭菌法）：是用蒸汽锅（或普通锅）常压法（间歇灭菌法）：是用蒸汽锅（或普通锅） 蒸，温度不超过蒸，温度不超过100。每次一小时，共三次，。每次一小时，共三次， 每次间隔每次间隔24小时（杀死孢子）。小时（杀死孢子）。 2. 湿热灭菌：利用蒸气杀菌。湿热灭菌：利用蒸气杀菌。 一、无菌技术一、无菌技术第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 高压法：锅内增加压力时则温度随之增高。高压法：锅内增加压力时则温度随之增高。 温度为温度为112.6；灭菌；灭菌30分钟。分钟。 温

6、度为温度为120121；灭菌；灭菌20分钟。分钟。 生物微生物的纯培养和显微性技术 本法系用滤过方法除去活的或死的微生物的方法，本法系用滤过方法除去活的或死的微生物的方法， 是一种机械除菌的方法。本法主要用于对热极不稳是一种机械除菌的方法。本法主要用于对热极不稳 定的药物小针剂或冻干粉针制剂的除菌。定的药物小针剂或冻干粉针制剂的除菌。 除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材 料，为保证阻止细菌和细菌孢子通过滤器，滤膜的料，为保证阻止细菌和细菌孢子通过滤器，滤膜的 孔径一般不超过孔径一般不超过0.22m。 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯

7、培养和显微性技术 对于接种针或其它金对于接种针或其它金 属用具灭菌，可直接属用具灭菌，可直接 在酒精灯火焰上烧至在酒精灯火焰上烧至 红热。此外在接种过红热。此外在接种过 程中，试管或三角瓶程中，试管或三角瓶 口，也采取通过火焰口，也采取通过火焰 达到灭菌的目的。达到灭菌的目的。 4. 火焰灭菌火焰灭菌 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 70的酒精：操作前手或器皿的表面杀菌，载玻的酒精：操作前手或器皿的表面杀菌，载玻 片，盖玻片的浸泡等。片，盖玻片的浸泡等。 1:1000 新洁尔灭溶液，浸泡时间为新洁尔灭溶液，浸泡时间为30分钟，常用分钟，常用 于表面的消毒。于表面的消毒

8、。 福尔马林（福尔马林（40甲醛液）：用于空间熏蒸灭菌，甲醛液）：用于空间熏蒸灭菌， 加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气体。注意将空加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气体。注意将空 间密闭并维持间密闭并维持24小时。小时。 5. 药物灭菌药物灭菌 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 用于接种室等空气灭菌。用于接种室等空气灭菌。 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 n压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广湿热消毒，用途广 n电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃器小时）。主要用干玻璃器 皿消毒皿消毒 n滤器：滤器：过

9、滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血 清、酶液等均采用滤过法除菌清、酶液等均采用滤过法除菌 n超净工作台：超净工作台：为操作提供无菌环境为操作提供无菌环境 n紫外灯：紫外灯：紫外线消毒。紫外线消毒。 主要用于培养室主要用于培养室空气、操作台、塑料空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒培养皿和培养板等表面消毒 常用的灭菌器具及应用常用的灭菌器具及应用 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 一、无菌技术一、无菌技术 n用接种针用接种针或或接种环接种环分离微生物，或将微生物从一分离微生物，或将微生物从一 个培养器皿转接到

10、另一个培养器皿进行培养。火焰个培养器皿转接到另一个培养器皿进行培养。火焰 旁边或无菌箱或无菌室进行。旁边或无菌箱或无菌室进行。 n接种针采用可以迅速加热和冷却的镍铬合金制备；接种针采用可以迅速加热和冷却的镍铬合金制备； n液体培养物用无菌移液管或移液器液体培养物用无菌移液管或移液器 生物微生物的纯培养和显微性技术 无菌操作台无菌操作台 火焰旁无菌区火焰旁无菌区 n超净工作台的工作原理是超净工作台的工作原理是 利用鼓风机驱动空气遁过利用鼓风机驱动空气遁过 高效滤器除去空气中的尘高效滤器除去空气中的尘 埃颗粒，使空气得到净化。埃颗粒，使空气得到净化。 净化空气徐净化空气徐徐通过工作台徐通过工作台

11、面，使工作台内构成无菌面，使工作台内构成无菌 环境。环境。 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 一、无菌技术一、无菌技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 菌落（菌落（colony） ：由单个微生物在适宜的固体培养基：由单个微生物在适宜的固体培养基 表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见 的、有一定形态结构的子细胞生长群体。的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈 片状，这就是菌苔。片状，这就是菌苔。 生物微生物的纯培养和显微性技术

12、 菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜 色及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。色及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。 生物微生物的纯培养和显微性技术 细细 菌菌 菌菌 落落 菌落的形态是鉴定菌种的重要特征菌落的形态是鉴定菌种的重要特征 沙门菌沙门菌 生物微生物的纯培养和显微性技术 放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌 菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、 难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为

13、粉难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉 末状或颗粒状的典型放线菌菌落。末状或颗粒状的典型放线菌菌落。 生物微生物的纯培养和显微性技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 n 在自然界中，各种各样的微生物总是混杂在一起的，在自然界中，各种各样的微生物总是混杂在一起的， 要研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微生物要研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微生物 分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种微生物。分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种微生物。 这种方法叫纯种微生物的分离。这种方法叫纯种微生物的分离。 n 大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和单细胞藻大多数细菌、酵母菌以及许多真菌

14、和单细胞藻 类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适 宜的平板分离法很容易得到纯培养。宜的平板分离法很容易得到纯培养。 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 培养平板（培养平板（culture plate） n克隆（克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落，即一一个单细胞繁殖形成的菌落，即一 个纯种细胞群或克隆。个纯种细胞群或克隆。 n固体培养基：固体培养基：琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。 n平板：平板：即培养平板（即培养平板（culture plate), 融化的固体

15、融化的固体 培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板， 用于分离、培养微生物。用于分离、培养微生物。 生物微生物的纯培养和显微性技术 n稀释倒平板法稀释倒平板法 n涂布平板法涂布平板法 n平板划线分离法平板划线分离法 n稀释摇管法稀释摇管法 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 稀释：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释稀释：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释 （如（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000.）；）； 倒平板：然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷倒平板：然后分别取不同稀释液

16、少许，与已熔化并冷 却至却至50左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培 养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板；养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板； 培养：保温培养一定时间即可出现菌落。随后挑取该培养：保温培养一定时间即可出现菌落。随后挑取该 单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 纯种微生物的分离方法纯种微生物的分离方法 生物微生物的纯培养和显微性技术 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显微性

17、技术 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 稀释倒平板法因为细菌与稀释倒平板法因为细菌与50培养基混合导致某培养基混合导致某 些热敏感菌死亡，及好氧菌埋在培养基中缺乏氧些热敏感菌死亡，及好氧菌埋在培养基中缺乏氧 气影响生长，所以更常用涂布平板法。气影响生长，所以更常用涂布平板法。 n 先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板；先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板； n 将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面， 再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面；再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面； n 经培养后

18、挑取单个菌落；经培养后挑取单个菌落； 生物微生物的纯培养和显微性技术 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 n接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等 划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。 平板划线分离平板划线分离 生物微生物的纯培养和显微性技术 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 n厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。 n操作：盛培养基试管加热融化

19、，冷却至操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50， 待分离待分离 材料用这些试管梯度稀释材料用这些试管梯度稀释 ，摇匀，冷凝，石蜡封口，摇匀，冷凝，石蜡封口 生物微生物的纯培养和显微性技术 物理方法物理方法 A抽气法抽气法将培养物置真空干燥器中将培养物置真空干燥器中 抽真空，再培养。抽真空，再培养。 B充气法充气法把培养物放一密闭贮器中把培养物放一密闭贮器中 充入充入N2（排尽空气）。（排尽空气）。 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 化学方法化学方法 A化学吸氧法化学吸氧法利用化学反应耗氧达到形利用化学反应耗氧达到形 成厌氧环境的目的。成厌氧环

20、境的目的。 用焦性没食子酸（用焦性没食子酸（1g）与）与NaOH（10%）反）反 应除氧（应除氧（100ml空气中的空气中的O2）。）。 密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌 氧环境氧环境 NaHSO3+NaCO3混和反应耗氧混和反应耗氧 B培养基预还原法培养基预还原法 培养基中加入还原剂（半胱氨酸、培养基中加入还原剂（半胱氨酸、Na2S Vc） 再隔绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。再隔绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。 生物方法生物方法 与需氧微生物共同培养与需氧微生物共同培养 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显

21、微性技术 n厌氧微生物分离装置：厌氧微生物分离装置： 厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 n一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等， 需要用液体培养基分离来获得纯培养。需要用液体培养基分离来获得纯培养。 n接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个 试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试 管中大多数（管中大多数（95）没有，那么有微生物的可能）没有，那么有微生物的可能 是纯培养

22、，否则可能性下降。是纯培养，否则可能性下降。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 单细胞（单孢子）显微分离单细胞（单孢子）显微分离 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 利用选择培养基直接分离利用选择培养基直接分离 对某微生物生长需要了解后，根据微生物的特对某微生物生长需要了解后，根据微生物的特 性设计培养基，即使该微生物在混杂群体中很性设计培养基，即使该微生物在混杂群体中很 少也可分离。少也可分离。 生物微生物的纯培养和显微性技术 土悬

23、液土悬液培养基培养基+硫磺硫磺分离出硫杆菌分离出硫杆菌 土悬液土悬液以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基分分 离出能降解羟基苯甲酸的微生物。离出能降解羟基苯甲酸的微生物。 特定的环境条件特定的环境条件 仅适应于该条件的微生物旺盛生长仅适应于该条件的微生物旺盛生长 待分离微生物在群落中的数量大大增加待分离微生物在群落中的数量大大增加 从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物 生物微生物的纯培养和显微性技术 纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合

24、混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合 培养物。培养物。 二元培养物二元培养物: 培养物只含两种微生物，并有意识保持两培养物只含两种微生物，并有意识保持两 者之间者之间 的特定关系的培养物为二元培养物。的特定关系的培养物为二元培养物。 例如寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。对于例如寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。对于 病毒来说，二元培养物是在实验室控制条件下可能达病毒来说，二元培养物是在实验室控制条件下可能达 到的最接近于纯培养的培养方法。到的最接近于纯培养的培养方法。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 （一）菌种的衰退与

25、复壮的概念（一）菌种的衰退与复壮的概念 1.衰退（衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程：菌种在培养或保藏过程 中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生 产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌 种的衰退。种的衰退。 衰退的原因：基因突变，分离现象。衰退的原因：基因突变，分离现象。 常见的衰退现象：常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变；菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少；生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；代谢产物生产能力或其对宿主寄

26、生能力下降； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 2、 菌种的复壮（菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢：使衰退的菌种恢 复原来优良性状。复原来优良性状。是指在菌种已发生衰退的情况下，是指在菌种已发生衰退的情况下， 通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未 衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行

27、纯种是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种 的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。 实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。 菌种的复壮措施：菌种的复壮措施： 纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法 等）。等）。 通过寄主体内生长进行复壮通过寄主体内生长进行复壮（如（如Bacillus thuringiensis的复壮）的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以淘汰已

28、衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以 杀死生命力较差的已衰退个体）杀死生命力较差的已衰退个体）。 采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 3、防止菌种衰退的方法：、防止菌种衰退的方法： 控制传代次数控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配 率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法， 可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件；选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生 物而言，通常采用稳定的单核孢

29、子进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 （二）菌种保藏（二）菌种保藏 1. 定义：就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微定义：就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微 生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。 2. 原理：挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧原理：挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧 的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃 的休眠状态以达保持纯种的目的。的休眠状态以达

30、保持纯种的目的。 3.目的：存活，不丢失，不污染目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种随时为生产、科研提供优良菌种 不杂、不乱、不杂、不乱、 不衰、不退不衰、不退 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 连续移接连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等） 使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到 半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得 到保藏，有的可保藏几十年或更长的

31、时间。到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物 恢复活力。恢复活力。 n对于生产中使用的菌种保藏培养基，要求比对于生产中使用的菌种保藏培养基，要求比 较丰富的氮源，以防止菌种退化变质。较丰富的氮源，以防止菌种退化变质。 生物微生物的纯培养和显微性技术 传代培养保藏传代培养保藏隔绝空气低温保藏隔绝空气低温保藏 冷冻保藏冷冻保藏保护剂保护剂+菌种菌种零下零下196度速冻度速冻 保存，或保存，或-70度冷冻室保存，度冷冻室保存，-20-30度普通冰度普通冰 箱冷冻室保存。箱冷冻室保存。 干燥保藏干燥保藏砂土管保存法和冷冻

32、真空干燥保砂土管保存法和冷冻真空干燥保 藏法藏法 生物微生物的纯培养和显微性技术 3、方法：、方法： 斜面低温保藏法斜面低温保藏法 原理：低温原理：低温 方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至生长完适温培养至生长完 全全4冰箱保藏冰箱保藏每隔一段时间移接一次每隔一段时间移接一次 说明：适于生产和科研中经常采用的菌种；说明：适于生产和科研中经常采用的菌种； 保藏时间：保藏时间： 霉霉 4个月个月 酵酵 46个月个月 放放 3个月个月 细细 12个月个月 培养基应少含或不含糖分（尤以细菌）培养基应少含或不含糖分（尤以细菌） 试管密封以隔绝空气试管密封以隔绝空

33、气 优：方法简单，成活率高优：方法简单，成活率高 缺：保存时间短，传代次数多，易变异。缺：保存时间短，传代次数多，易变异。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 石蜡油封藏法石蜡油封藏法 原理：低温、缺氧原理：低温、缺氧 方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管 内（油量高出斜面内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱包扎后竖直放入冰箱 保藏。保藏。 说明：液体石蜡于说明：液体石蜡于170干热灭菌干热灭菌1h。 斜面培养基能干燥则保藏效果好。斜面培养基能干燥则保藏效果好。 保藏时间保藏时间12年。年

34、。 适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆 菌。菌。 能同化烃类的微生物不宜用此法。能同化烃类的微生物不宜用此法。 生物微生物的纯培养和显微性技术 砂土管保藏法砂土管保藏法 原理：干燥、缺氧原理：干燥、缺氧 方法：取河砂若干，方法：取河砂若干，24目过筛目过筛10%HCl浸泡浸泡 24h水洗至中性水洗至中性烘干后分装安瓿瓶或试管，加烘干后分装安瓿瓶或试管，加 棉塞棉塞1kg/cm、23分钟分钟无菌检查无菌检查每管加孢子每管加孢子 悬液，接种环拌匀悬液，接种环拌匀干燥器中干燥干燥器中干燥火焰熔封或火焰熔封或 蜡封蜡封干燥器中保藏干燥器中保藏 说明：适于保藏霉菌和放线

35、菌孢子及芽孢杆菌说明：适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌 时间时间210年年 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法 原理：低温、干燥、真空（缺氧）原理：低温、干燥、真空（缺氧） 方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速 冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接 升华为水蒸汽，以达干燥的目的。升华为水蒸汽，以达干燥的目的。 常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛

36、奶、淀粉、葡聚糖 说明：目前最有效的保藏方法。说明：目前最有效的保藏方法。 适于细、放、酵、霉、病毒的保存。适于细、放、酵、霉、病毒的保存。 保存时间保存时间120年。年。 存活率高、变异率低，但手续麻烦，且需一定设备条存活率高、变异率低，但手续麻烦，且需一定设备条 件。件。 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（温冰箱中（ -196）。）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 第一

37、节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 ：广泛收集科研和生产菌种、广泛收集科研和生产菌种、 菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及 便于研究、交换和使用的目的。便于研究、交换和使用的目的。 ： 中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（法国里昂巴斯德研究所（IPL） 国内外菌种保藏机构：国内外菌种保藏机构： 第一节第一节 微生物的

38、分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 方法名称方法名称主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评价评价 冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法冰箱保藏法（半固体）（半固体） 石蜡油封藏法石蜡油封藏法* 沙土保藏法沙土保藏法 冷冻干燥法冷冻干燥法 低温低温 低温低温 低温、缺氧低温、缺氧 干燥、无营养干燥、无营养 干燥、无氧、低干燥、无氧、低 温、有保护剂温、有保护剂 各大类各大类 细菌、酵母菌细菌、酵母菌 各大类各大类* 产孢子微生物产孢子微生物 各大类各大类 36月月 612月月 12年年 110年年 515年年 简便简便 简便简便 简便简便 简便简

39、便 有效有效 简便简便 有效有效 第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 生物微生物的纯培养和显微性技术 决定显微观察效果的两个重要因素决定显微观察效果的两个重要因素 分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力 反差：指样品区别于背景的程度反差：指样品区别于背景的程度 1.显微镜的种类及原理显微镜的种类及原理 2.显微观察样品的制备显微观察样品的制备 生物微生物的纯培养和显微性技术 普通光学显微镜普通光学显微镜 暗视野显微镜暗视野显微镜 相差显微镜相差显微镜 荧光显微镜荧光显微镜 透射电子显微镜透射电子显微镜 扫描电子显微镜扫描电子显微镜 扫描

40、隧道显微镜扫描隧道显微镜 生物微生物的纯培养和显微性技术 机械装置：镜座、支架、载物机械装置：镜座、支架、载物 台、调焦螺旋台、调焦螺旋 光学系统：物镜、目镜、聚光光学系统：物镜、目镜、聚光 器器 普通显微镜结构示意图普通显微镜结构示意图 生物微生物的纯培养和显微性技术 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 D = 0.61/ NA = 0.61/sin/2 其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；NA为镜口率为镜口率 sin/2，n=标本和物标本和物 镜之间介质折射率（空气中为镜之间介质折射率（空气中为1） ；=镜口角（样品对物镜镜口的镜口角（样品对物镜镜口的

41、 张角，最大可为张角，最大可为140度，此时，度，此时，sin(/2)约为约为0.94 ） 。 思考：思考：如何提高显微镜的分辨能力？如何提高显微镜的分辨能力？ 生物微生物的纯培养和显微性技术 可见光的波长在可见光的波长在39007600，光学玻璃透镜，光学玻璃透镜 分辨本领的极限值可达分辨本领的极限值可达0.2微米；而电子束的微米；而电子束的 波长约为可见光的十万分之一波长约为可见光的十万分之一 。 常见显微镜的分辨率：常见显微镜的分辨率： 光学显微镜光学显微镜 200nm 扫描电子显微镜扫描电子显微镜 1nm 透射电子显微镜透射电子显微镜 0.1nm 生物微生物的纯培养和显微性技术 制作光

42、学镜头所用的玻璃折射率为制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质，所用介质 的折射率越接近玻璃的越好。的折射率越接近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般；介质为空气，镜口率一般 为为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 生物微生物的纯培养和显微性技术 利用特殊聚光器实现给样品斜射照明，由样品反利用特殊聚光器实现给样品斜射照明，由样品反 射或折射的光再进入物镜，这样整个视野是暗的，射或折射的光再进入物镜，这样整个视野是暗的， 只有样品是明亮的。只有样品是明亮的。 主要用于观

43、察生活细菌的运动性。主要用于观察生活细菌的运动性。 生物微生物的纯培养和显微性技术 暗视野显微镜下苍白密螺旋体暗视野显微镜下苍白密螺旋体 生物微生物的纯培养和显微性技术 n光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大 变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以 分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射 光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显 微镜

44、看到。微镜看到。 n相差显微镜（相差显微镜（phase contrast microscope ）采用特殊光学装置：）采用特殊光学装置： 环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人 眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞 内的某些显微结构。内的某些显微结构。 n其发明人其发明人F.ZernikeF.Zernike因此获因此获19531953年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。 生物微生物的纯培养和显微性技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 荧光显微技术原理：荧光素吸收荧光

45、显微技术原理：荧光素吸收uv放出波长较长的可见放出波长较长的可见 光，因此在光，因此在uv照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现 为光亮有色物体。在免疫学和分子生物学应用广泛。为光亮有色物体。在免疫学和分子生物学应用广泛。 生物微生物的纯培养和显微性技术 现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。右图中所示为现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。右图中所示为 荧光染色的铜绿假单胞杆菌（荧光染色的铜绿假单胞杆菌（ 革兰氏染色阴性，绿色）和蜡样芽胞杆菌（革兰氏染色阳性，橙色）。革兰氏染色阴性，绿色）和蜡样芽胞杆菌（革兰氏染色阳性，橙色）。 生物

46、微生物的纯培养和显微性技术 用波长短的电磁波取代可见光，使分用波长短的电磁波取代可见光，使分 辨率提高。辨率提高。 工作原理类似，因光源不同，有区别工作原理类似，因光源不同，有区别: 1）电子遇空气中分子会发生偏转使）电子遇空气中分子会发生偏转使 物象不清楚，因此镜筒高真空；物象不清楚，因此镜筒高真空； 2)电子带电荷，电镜是用电磁圈使之电子带电荷，电镜是用电磁圈使之 聚焦聚焦 ； 3)电子像人眼看不到，用荧光屏显示电子像人眼看不到，用荧光屏显示 或感光胶片记录。或感光胶片记录。 生物微生物的纯培养和显微性技术 扫描电子显微镜扫描电子显微镜 大肠杆菌扫描电镜图大肠杆菌扫描电镜图 工作原理与光学

47、显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激 发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。 电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于 荧光屏上。荧光屏上。 主要用于：样品表面结构主要用于：样品表面结构 生物微生物的纯培养和显微性技术 80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。 其横向分辨率：其横向分辨率：0.10.2nm，纵向分辨率：，纵

48、向分辨率：0.001nm 这种分辨率足以对单个原子观察。这种分辨率足以对单个原子观察。 用这种显微镜可直接观察蛋白质、用这种显微镜可直接观察蛋白质、DNA、RNA等分子的等分子的 结构。结构。 生物微生物的纯培养和显微性技术 厨房抹布上的细菌和霉菌 厨房抹布上的细菌和霉菌 棉纤维上的汗垢棉纤维上的汗垢 扫描隧道显微镜下的扫描隧道显微镜下的DNA 生物微生物的纯培养和显微性技术 生物微生物的纯培养和显微性技术 二、显微镜和显微技术二、显微镜和显微技术 n 样品好坏直接影响观察结果。样品好坏直接影响观察结果。 n 考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制 样方法

49、，尽可能使样品生理结构稳定，采用样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用 各种方法提高反差。各种方法提高反差。 生物微生物的纯培养和显微性技术 二、显微镜和显微技术二、显微镜和显微技术 光学显微镜制样光学显微镜制样 活体观察活体观察 染色染色 压滴法压滴法 悬滴法悬滴法 菌丝埋片法菌丝埋片法 活菌活菌死菌死菌 美蓝染色美蓝染色 简单染色简单染色 鉴别染色鉴别染色 革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色 生物微生物的纯培养和显微性技术 特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄 食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 。 压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察；压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察； 悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻 片直接观察片直接观察 ； 菌丝埋片法：无菌小