比色分析法和分光光法的实验操作法

1、实验一 比色分析法和分光光度法 比色分析法和分光光法的实验操作法 通过生物化学实验应该做到 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实 验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，验的基本原理，学会严密地组织自己的实验， 合理地安排实验步骤和时间。合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种 生物化学实验仪器。生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能， 提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地 进行所有的实验。进

2、行所有的实验。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技 术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今 后参加科研工作打下坚实的基础。后参加科研工作打下坚实的基础。 比色分析法和分光光法的实验操作法 注意事项 不许迟到早退。 上课必须穿白大衣。 实验室内禁止吃东西。 未经允许，不得随意动实验器材。 实验后认真打扫卫生。 按时上交实验报告册。 遇到问题及时沟通。 比色分析法和分光光法的实验操作法 成 绩 理论课（80）+实验课（20）=100分。 实验课（20） =(报告册+课堂表现)（10）+考试成绩 （10）。 报告册：书写

3、的认真情况，对实验中出现的问题分析 和看法的总结等。 课堂表现：是否有迟到早退现象，注意听讲，打扫卫 生等。 比色分析法和分光光法的实验操作法 内容 3 比色分析法和分光光度法比色分析法和分光光度法 1 比色分析的测定方法比色分析的测定方法 2 分光光度计的基本结构与使用分光光度计的基本结构与使用 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定 4 3 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析法 概念：用比较溶液颜色深浅来确定溶液中概念：用比较溶液颜色深浅来确定溶液中 有色物质含量的方法有色物质含量的方法 比色分析法和分光光法的实验操作法 分光光度法 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来概念：是利用物质所特

4、有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、 快速。对于复杂的组分系统，无须分离快速。对于复杂的组分系统，无须分离 即可检测出其中所含的微量组分的特点。即可检测出其中所含的微量组分的特点。 比色分析法和分光光法的实验操作法 基本原理 一一. .光由几部分组成：光由几部分组成：3 3部分部分 比色分析法和分光光法的实验操作法 ：只具有一种波长的光。：只具有一种波长的光。 ：由两种以上波长组成的光，如白光。：由两种以上波长组成的光，如白光。 可见光分为哪几个单色光？可见光分为哪几个单色光？

5、 二、二、物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 白光白光青蓝青蓝 青青 绿绿 黄黄 橙橙 红红 紫紫 蓝蓝 1、光的互补性与物质的颜色 比色分析法和分光光法的实验操作法 是由于物质对不同波是由于物质对不同波 长的光具有选择性的吸收作用而长的光具有选择性的吸收作用而 产生的，产生的， 。 例：硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈蓝色；例：硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈蓝色； 高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。 如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以 得白光，这两种光就叫得白光，这两种光就叫。物质呈现

6、的颜色和。物质呈现的颜色和 吸收的光颜色之间是互补关系。吸收的光颜色之间是互补关系。 比色分析法和分光光法的实验操作法 /nm颜色颜色互补光互补光 400- 450 紫黄绿 450- 480 蓝蓝黄黄 480- 490 绿蓝绿蓝橙橙 490- 500 蓝绿蓝绿红红 500- 560 绿绿红紫红紫 560- 580 黄绿黄绿紫紫 580- 610 黄黄蓝蓝 610- 650 橙橙绿蓝绿蓝 650- 760 红红蓝绿蓝绿 不同颜色的可见光波长及其互不同颜色的可见光波长及其互 补光补光 白光白光青蓝青蓝 青青 绿绿 黄黄 橙橙 红红 紫紫 蓝蓝 比色分析法和分光光法的实验操作法 入射光入射光 出射光

7、出射光 反射光反射光 IrIa 吸收光吸收光 比色分析法和分光光法的实验操作法 分光光度法的原理 LambertLambert定律定律 I0 I 入射光强度 透过光强度 L C 液层厚度液层厚度 0 I I T 透光率 lk I I o lg 比色分析法和分光光法的实验操作法 分光光度法的原理 BeerBeer定律定律 ck I I o lg I0 I 入射光强度 透过光强度 L C 液层厚度液层厚度 比色分析法和分光光法的实验操作法 分光光度法的原理 Lambert-Beer定律 lk I Io lgck I Io lg lck I Io lg I I lgAA absorbance I I

8、 lg I I lg0I I I lgII 0 I I lgI I 0 0 0 0 0 0 0 表示，即用 ），度，称作吸光度（表示溶液对光吸收的程由此可见， 溶液不透光。乎被溶液完全吸收，即值无穷大，表示光线几时，当 线较多；值大，表示溶液吸收光时，当 光线；，表示溶液完全不吸收时，当 公式的意义： lckA 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析法和分光光法的实验操作法 一、波长的选择标准：吸收MAX 干扰MIN 比色分析的测定方法 比色分析法和分光光法的实验操作法 二、待测溶液浓度的计算方法 1.利用标准管计算测定物的含量利用标准管计算测定物的含量 2.2.利用标准曲线计算测定物含量

9、利用标准曲线计算测定物含量 3.3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度利用消光系数法求出待测溶液的浓度 比色分析法和分光光法的实验操作法 利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（）标准液的吸光度（AS），同时也测），同时也测 定末知浓度（定末知浓度（CU）的吸光度（）的吸光度（AU），）， Cs As Au Cu Cs Cu As Au AuAs LsLuKs：Ku KsCsLsAsKuCuLu：Au 即 比值之比值也等于两浓度之与所以 因为 根据定律得 比色分

10、析法和分光光法的实验操作法 利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光 度。然后以各管吸光度（度。然后以各管吸光度（A A）为纵坐标，各管的浓度（）为纵坐标，各管的浓度（C C）为横坐标，）为横坐标， 在方格坐标纸上作图。在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通 过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质 测定时，无需再作标准管，据测定管吸

11、光度从标准曲线上即可求得测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得 测定物的浓度。测定物的浓度。 比色分析法和分光光法的实验操作法 标准曲线标准曲线(浓度浓度-吸光度曲线）吸光度曲线） 对末知浓度对末知浓度 物质测定时物质测定时 ，无需再作，无需再作 标准管，据标准管，据 测定管吸光测定管吸光 度从标准曲度从标准曲 线上即可求线上即可求 得测定物的得测定物的 浓度。浓度。 0.2 0.8 0.4 0.6 A C 比色分析法和分光光法的实验操作法 标准管法 标准溶液：As=KsCsLs 待测溶液：Au=KuCuLu Cu=Au/AsCs 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析

12、法和分光光法的实验操作法 比色分析法和分光光法的实验操作法 蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有 共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质， 吸收高峰在吸收高峰在280 nm波长处。波长处。 在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 (OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测与其含量呈正比关系，可用作定量测 定。定。 比色分析法和分光光法的实验操作法 碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复 合物（紫色）合物（紫色） 比色分析法和分光光法

13、的实验操作法 2021-4-27Biochemistry Experiments27 蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸 磷钼酸还原而呈蓝色磷钼酸还原而呈蓝色 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析法和分光光法的实验操作法 （1）学习）学习Folin酚法测定蛋白质含量的原理和方法酚法测定蛋白质含量的原理和方法 比色分析法和分光光法的实验操作法 一、器材一、器材 l1 1 试管及试管架试管及试管架 l2 2 移液管移液管(5(5、1 1、0.5ml0.5ml、 0.2ml) 0.2ml) l3 3 可

14、见分光光度计可见分光光度计 l二、试剂（在实验手册中，有配制方法）二、试剂（在实验手册中，有配制方法） l1 1 标准标准BSABSA溶液溶液 l2 Fo1in2 Fo1in酚试剂酚试剂 l3 3 碱性铜液（现用现配制），且注意配制时，要先混合碱性铜液（现用现配制），且注意配制时，要先混合B B液再加液再加A A液。液。 l4 0.9% NAcl4 0.9% NAcl 比色分析法和分光光法的实验操作法 分光光度计的基本结构 光源光源 单色单色 光器光器 吸收池吸收池检测器检测器显示显示 钨丝灯钨丝灯 可见光源可见光源 3501000nm3501000nm 氢灯氢灯 氘灯氘灯 紫外光源紫外光源

15、200360nm200360nm 棱镜棱镜 衍射光栅衍射光栅 玻璃比色杯玻璃比色杯 石英比色杯石英比色杯 硒光电池硒光电池 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 玻璃玻璃能吸收能吸收UVUV 光，仅适用于可见光，仅适用于可见 光区。光区。 石英石英不能吸收不能吸收 紫外光，适用于紫紫外光，适用于紫 外光区。外光区。 将光信号转变为将光信号转变为 电信号的装置。电信号的装置。 记录装置：记录装置： 讯号处理和讯号处理和 显示系统。显示系统。 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析法和分光光法的实验操作法 分光光度计使用的注意事项 比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不得随意挪比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不得随意挪 用。用。 比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。 盛液时达到比色杯的盛液时达到比色杯的3/43/4即可，不能太满，外壁如有液体，只即可，不能太满，外壁如有液体，只 能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。 比色分析法和分光光法的实验操作法 比色分析法和分光光法的实验操作法 0 30 45 60 90 120