猪瘟检测与防治

1、重庆市高教自考本科毕业论文论文题目：猪瘟检测与防治准考证号：5 姓名：普传贵 指导教师姓名 彭洁 职称 讲师 考生单位 云南省农业职业技术学院 邮 编 电话 专业名称 畜牧兽医 论文提交日期 2015年3月 论文答辩日期2013年4月 主考单位 重庆西南大学 二零一五年四月十日目录摘要51.病原学特征52流行病学63.临床症状64.病理变化75.猪瘟实验室常规诊断技术85.1免疫荧光试验免疫荧光试验（FAT）85.2 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）95.3常规反转录-聚合酶链反应聚合酶链反应（PCR）105.4实时荧光定量PCR 技术115.4核酸探针技术核酸探针技术125.5

2、基因芯片检测技术126.猪瘟的防治13参考文献16 猪瘟检测与防治 普传贵摘要：猪瘟是威胁养猪业最严重的传染病，对于疫情严重的猪场，只有采取乳猪超前免疫，才能够控制猪瘟的流行。猪瘟是威胁养猪业最严重的传染病，对于疫情严重的猪场，只有采取乳猪超前免疫，才能够控制猪瘟的流行。关键词：猪瘟 ；诊断；防治；猪瘟又称“烂肠瘟”，是由黄病毒科瘟毒病属的猪瘟病毒(CSFV)引起猪的一种急性、发热、接触性传染病。国际兽医局将其列为A类16种法定传染病之一，猪是该病毒唯一的自然宿主。急性病例呈败血症的临诊症状，剖检可见内脏器官出血、坏死和梗死。慢性经过的病例，主要是纤维素性坏死性肠炎。常有副伤寒及巴氏杆菌病继发

3、感染。1.病原学特征猪瘟病毒属黄病毒科、瘟病毒属。本病毒对外界环境的抵抗力较强，既能在冷冻条件下存活，也能在烟熏烤晒加工的肉品中存活；但不耐热，仅部分毒株可抵抗56温度。pH3.O或pH11.O可灭活；对乙醚、氯仿、 -丙烯内脂敏感；能被2氢氧化钠、1福尔马林、碳酸钠(4无水或10结晶碳酸钠+01去污剂)、离子和无离子去污剂、含1碘伏的磷酸灭活。 2流行病学（1）从发病区域上看，多为养猪密集的专业村，小型个体养殖场，疫源常常是外引猪所致，发病后，表现症状不明显，发现不及时或误诊，采取措施不当。（2）从发病时间看，全年发病最高峰是春季的3-4月份，其次是秋季的8-10月份。（3）从发病年龄看，春

4、季以断奶猪2060日龄多发。常常是引进猪未免或免后几天即开始发病，全群症状不一，死亡不高。秋季发病猪年龄不一，育肥猪也可发病，多为混合感染。（4）从发病群体看，发病率主要在个体养殖户和专业养殖村，疫源引进控制措施不当，综合防疫意识不强，使病毒得以扩散。其次为中 、小型混合型养殖场，饲养密度大，隔离措施不到位。大型种猪场发病率较低，综合防治能力大型种猪场发病率较低，综合防治能力强，基本能控制猪瘟的发生。 3.临床症状急性型：高热稽留(4142)。食欲减退，偶尔呕吐。嗜睡、挤堆。呼吸困难，咳嗽。结膜发炎，两眼有脓性分泌物。全身皮肤黏膜广泛性充血、出血。皮肤发绀，尤以肢体末端(耳、尾、四肢及口鼻部)

5、最显著。先短暂便秘，排球状带黏液(脓血或假膜碎片)粪块；后腹泻排灰黄色稀粪。大多在感染后515天死亡，小猪病死率可达100。 亚急性型：多年来一些地区散发一种所谓“无名高热”症，经研究证明多为猪瘟。因其潜伏期长，症状较轻不典型，病死率一般不超过50，抗菌药物治疗无效，称为“温和型”猪瘟。病猪呈短暂发热(一般为4041，少数达41以上)，无明显症状。母猪感染后长期带毒，受胎率低、流产、死产、木乃伊胎或畸形胎；所生仔猪先天感染，死亡或成为僵猪。慢性型：体温时高时低，呈弛张热型。便秘或下痢交替，以下痢为主。皮肤发疹、结痂，耳、尾和肢端等坏死。病程长，可持续1月以上，病死率低，但很难完全恢复。不死的猪

6、，常成为僵猪。多见于流行中后期或猪瘟常发地区。 4.病理变化急性型：白细胞及血小板减少。全身性出血、淤血，尤以(耳根、颈部、胸腹下、四肢内侧)皮肤、淋巴结、喉头、膀胱、肾、回盲处明显。脾不肿大，边缘有暗紫色稍突出表面的出血性梗死，为猪瘟特征性病变，但一般不常见，仅5070病例出现梗死病变。常见全身淋巴结肿大、出血，切面周边出血显著，杂有贫血变化，呈红白相间的大理石状，多见于颌下、颈部和腹腔淋巴结。 慢性型：主要为坏死性肠炎，一般在回盲瓣口、盲肠及结肠黏膜上形成同心轮状的纽扣状溃疡，突出于黏膜面，颜色黑褐,中央凹陷。通常无出血及炎性病变。全身性淋巴组织萎缩。仔猪常见胸腺萎缩，肋软骨连接处外生骨疣

7、。5.猪瘟实验室常规诊断技术5.1免疫荧光试验免疫荧光试验（FAT）猪瘟荧光抗体染色技术是将提纯后的抗CSFV 抗体IgG 标记上荧光物质，制成猪瘟荧光抗体染色试剂。用该试剂去着染猪病料（如病猪扁桃体、淋巴结、肾等）的冰冻切片或触片，然后利用荧光显微镜观察组织细胞内是否有亮绿色荧光。如果被观察的组织细胞内有亮绿色荧光，就是猪瘟病毒荧光抗体染色阳性，说明被检病料中有CSFV 感染。反之，被观察的组织细胞内没有亮绿色荧光，就是猪瘟病毒抗体染色阴性。利用荧光抗体技术检测病猪内脏器官可能存在的CSFV，对CSF 的早期诊断具有十分重要的意义。猪瘟荧光抗体染色技术在CSFV 感染早期检出率较高，不仅能检

8、出强毒抗原，还能检出低毒力病毒感染的带毒母猪，猪瘟的常规诊断需要45 d，而该项技术可在12 h 内作出判断，既快速又客观、准确，在规模化猪场临床上得到了广泛应用。所以目前许多规模化大猪场利用荧光抗体染色技术，有计划地对猪场进行猪瘟净化。Robert son 等首次将FA 运用于猪瘟病料和组织培养物的检测。张淑霞等从抗猪瘟高免血清中提取IgG，标记荧光素（FITC），制备出了猪瘟荧光抗体（CSFV-FA）。该抗体能够检测人工感染猪扁桃体中的病毒抗原，而且这种荧光反应能够被抗CSF 高免血清特异性抑制。应用CSFV-FA 可在病死猪的扁桃体、脾、肾、回肠末端等器官的触片或冰冻组织切片中发现病毒抗

9、原，也可先将可疑病料经无菌处理后接种于细胞培养物，随后再用CSFV-FA 检测出感染细胞中的猪瘟病毒抗原。FAT 法简单、快速、可靠，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定诊断试验。15.2 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）具有高度敏感性和特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断发展，酶联免疫测定的技术方法也得到发展和更新，Dot-ELISA、发光酶联免疫测定、免疫印迹法、BAS-酶联免疫吸附试验等方法都不断得到应用。周宗元等应用猪瘟兔化弱毒PEG 沉淀抗原HRP-S

10、PA 建立了HRP-SPA-ELISA 检测CSFV 抗体的方法，通过对5 份阴性血清和32 头仔猪注射疫苗前后不同时期的256 份血清进行检测，证明本法有较高的敏感性和特异性。余兴龙等以在大肠杆菌中高效表达的CSFV 的E2 基因产物为抗原，以HRP 标记的的兔抗猪IgG 为二抗，建立了检测CSFV 抗体的间接ELISA 方法，结果表明用E2 基因产物蛋白作为诊断猪瘟的抗原，具有特异性高、易纯化和成本低等特点。陆芹章等（2004）制备了猪瘟单克隆抗体，以ACI-ELISA法检测CSFV，并用PCR 方法作比较，结果表明30 份猪瘟阴、阳性病料的ACI-ELISA 试验结果与PCR 检测结果相

11、符本方法与动物接种、免疫荧光、血清中和等CSF 常规诊断方法比较，更加快速、准确、经济，且一次可检测大量样品，同时比PCR 方法耗时短、费用低，便于推广。陈振海（2005）等以CSFV GST-Erns 融合蛋白作抗原进行间接ELISA，结果表明用该方法检测CSFV 抗体具有很高的特异性和敏感性。目前，已有很多采用基于中和性单抗的竞争ELISA 方法来检测某些病原中和抗体的报道，说明利用CSFV 中和性单抗作为竞争抗体检测CSFV 中和抗体是可行的。梁冰冰等利用杆状病毒表达猪瘟病毒（CSFV），以重组E2 蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的E2 蛋白中和性单克隆抗体作为竞争抗体，建立了一种

12、用于检测CSFV 中和抗体的重组E2 蛋白竞争抑制ELISA（CI-ELISA）方法，该法操作简便、快速，适于现场应用，同时具有一般ELISA 的操作优点，可以用于大量现场样品的检测和流行病学监测。2.2 分子生物学诊断方法。55.3常规反转录-聚合酶链反应聚合酶链反应（PCR）应用反转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）成功测定了多株CSFV 的全基因序列，为猪瘟的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。因为在临床检测中要经常检测RNA 病毒，而通常所用的PCR 试剂盒是DNA 聚合酶，不能以RNA 为模板直接扩增，故在进行PCR 前，先将病毒RNA 逆转录为cDNA，所以建立了RT-

13、PCR 技术。随着人们对CSFV 分子生物学研究的深入，尤其是对CSFV Alfort株和Bresica 株基因组全序列的成功测定，使得RT-PCR 技术在CSFV 的研究中被广泛应用。RT-PCR 作为检测CSFV 的一种方法，其特异性强、灵敏度高、重复性好，操作也很简单，整个过程在1 d 内即可完成，能达到快速检测的目的，并且适合于各种含毒材料的检测，也可用于临床。此外，RT -PCR 技术还可区别与CSFV 相关的病毒，如BVDV，以及能引起和CSF 相似临床症状的猪病病毒，如亚洲CSFV、伪狂犬病病毒，其灵敏度可达100%。25.4实时荧光定量PCR 技术荧光定量PCR 技术是近年来发

14、展起来的一种核酸定量技术，因其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为核酸检测中的重要工具。它是在常规PCR 引物之外加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。该技术的研究也逐渐成为猪瘟诊断方法研究的方向。由于实时定量荧光PCR 仪可以同时检测多种荧光，因此可以进行多重检测，即在同一个反应体系中，将不同探针标记上不同的荧光基团，这样就可以同时检测多种疾病的病原，这也是疫病诊断的一个研究方向。Risatti 等（2003，2005）建立了一种实时荧光定量RT-PCR 方法检测CSFV，并与病毒分离作了比较，证明其敏感性高于病毒分离100%/72.4%），特异性略低于病毒分离（98.9% /

15、100%）。日本学者Ophuis 等（2006）应用荧光定量RTPCR方法对攻毒猪各组织脏器中的病毒进行了检测，结果发现早在攻毒后1 d 就在扁桃体中检测到了病毒的存在。Cho 等应用不同荧光基团标记的两条TaqMan-MG 探针建立了一种能鉴别韩国CSFV 野毒株和LOM 疫苗株的荧光RT-PCR 方法。35.4核酸探针技术核酸探针技术在分子标记的基础上，以病毒RNA 基因组为模板制备探针，在cDNA 合成之后，进行Southern blot，特异的核酸探针会在不同病毒基因组cDNA 上产生特异的条带。此方法具有特异性强、准确可靠的优点，但诊断费用较高。此法可用于不同毒株的分离和鉴定。Cru

16、ciere 等、Dable 等、Colijn 等利用CSFV 基因组RNA 构建cDNA，与BVDV 进行序列分析和比较，合成了6 个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异的杂交条带可以区别CSFV、BVDV 和BDV。我国赵启祖等研制了石门血毒P80 核酸探针，可对病毒RNA 进行定量检测，灵敏度达220 pg。核酸探针技术有特异性强、准确可靠的优点，但需要合成核酸探针，诊断费用较高。5.5基因芯片检测技术基因芯片是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，在基因表达谱、功能基因组、疾病基因诊断等基础研究及临床应用中已经显示出重要的理论意义和广泛的应用前景。它被誉为又

17、一次生命科学领域的革命，世界各国争相投入研究。基因芯片是指在一个很小的表面，通常是硅化玻璃，覆盖上成千上万的寡核苷酸，每一个固定在芯片上的特定位置都可以找到这个点，每个寡核苷酸反应芯片上有成千上万的拷贝互补信息，包括cDNA 芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片，主要目标是用于DNA 序列的测定、病原检测、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。基因芯片技术为动物疾病诊断提供了新的技术理念，出现可以替代传统方法的新技术，并形成新产品。目前，我国也正在研究应用基因芯片检测技术来诊断猪瘟，这将对我国猪瘟的防控具有深远意义。6.猪瘟的防治（1）加强饲养管理加强饲养管理和卫生工作十分重

18、要，尤其是规模化猪场，舍内定期大消毒，粪肥指定地点生物热处理，以减少猪瘟病的传播机会。（2）制定合理的免役程序猪瘟预防主要是疫苗免疫接种。一是仔猪一出生就预防接种；二是满月接种一次；三是春秋两防要接受上门防疫员的补种一次；四是要做好疫苗储藏、运输、保管等工作，保证其生物学效价。操作时必须坚持严格消毒、一猪一针，确保注射有效。（3）加强猪瘟的免疫监测进行免疫监测，就是定期从免疫猪群中抽样检查苗猪的抗体产生是否达到保护水平。对注射疫苗后抗体产生达不到保护水平的猪仔应及时补种，如补种后抗体水平仍上去的猪仔可以疑为先天感染或免疫耐受，应坚决淘汰。（4）消灭传染源猪瘟治疗目前尚无特效药，有些慢性猪瘟，猪

19、虽能长期存活，但生长速度极慢，也容易继发其它疾病，还成为猪瘟的疫源，因此，凡确诊为猪瘟和带病毒的猪一律扑杀销毁且深埋，严重的可做群体销毁处理，避免加剧猪瘟的传播。同时，应严格消毒病猪场地和圈舍，并空圈3个月以上，在此期间，每20天进行一次严格的消毒，确保养殖环境的净化和安全，获得有效地防疫效果。（5）猪瘟的免疫接种，包括被动免疫和主动免疫，是当前防制猪瘟的主要手段。被动免疫应用高免血清，主动免疫则有疫苗。但因使用高免血清价高，且因应用强毒，有造成散毒的危险，现已禁止使用。弱毒疫苗，产生免疫力快，且坚强而持久。关键是要选择和培育出一株安全性稳定、免疫性强的弱毒株。许多弱毒株仍保留一定程度的残余致

20、病力，必须同时注射一定量的免疫血清以减轻其反应。就全世界来说，猪瘟弱毒疫苗已经广泛应用。6 （6）猪瘟免疫程序 规模养猪场免疫：商品猪：2535日龄初免，6070日龄加强免疫一次。种猪：2535日龄初免，6070日龄加强免疫一次，以后每46个月免疫一次。散养猪免疫：每年春、秋两季集中免疫，每月定期补免。紧急免疫：发生疫情时对疫区和受威胁地区所有健康猪进行一次强化免疫。最近1个月内已免疫的猪可以不进行强化免疫。免疫效果监测：免疫21天后，进行免疫效果监测。猪瘟抗体阻断ELISA检测试验抗体阳性判定为合格，猪瘟抗体正向间接血凝试验抗体效价25判定为合格。存栏猪抗体合格率达到70%判定为合格。 （7

21、）猪瘟免疫剂量：仔猪加强免疫。仔猪4050日龄再打一次预防针，剂量为每头猪23头份。母猪配种前免疫。母猪配种前需要注射一次猪瘟疫苗，剂量为每头猪23头份。此时接种的关键是必须保证所有待配种母猪(后备母猪和经产母猪)都注射，且最好在配种前一周左右就注射。可使母猪在怀孕期有高度免疫来保护胎儿，同时还可以保证有较高的初奶抗体水平，使乳猪得到母源抗体保护。后备公猪和配种公猪按常规程序免疫。也就是作种用的公猪每年免疫一至二次(在春季或秋季注射疫苗)，剂量为每头猪12头份。商品猪整个饲养期预防接种2次。第一次在出生后吮吸母乳之前(称超前免疫)免疫，接种兔化猪瘟弱毒苗，剂量为每头猪12头份。第二次在5560

22、日龄再接种34头份冻干苗。应注意不能在转群时注射猪瘟疫苗，应在转群前10天或转群后710天接种，以避免因转群应激而诱发猪瘟。7致谢!历时将近两个月的时间终于将这篇论文写完，在论文写作的过程中遇到了很多的困难和障碍，都在老师和同学们的帮助下度过了，尤其要感谢我的论文指导老师郑锦玲老师，她对我进行了无私的指导和帮助。不厌其烦的帮助进行论文的修改和改进。在此向帮助和指导过起我的指导老师表示最衷心的感谢！ 感谢这篇论文所涉及到的各位学者，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我将很难完成本篇论文的写作。 由于我学的知识水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请老师给予批评和指正！ 参考文献1 何若钢，张恒博，李秀宝，等. 荧光抗体技术在猪瘟净化的应用研究J.黑龙江畜牧兽医，2008-9.2 俞伏松，车勇，江斌，等.PT-RCR和免疫荧光抗体试验检测猪瘟病毒的比较研究J.福建农业学报,2007-3.3 朱小甫，李晓成，陈德坤，等.猪瘟诊断技术研究进展J.中国动物检疫，2007-2.4 杨晓梅，林毅，邓小东，等.猪瘟 PPA-ELISA和DOT-ELISA检测猪瘟抗体的比较及其应用J.西南农业学报，2000（增刊）. 5 陈龙宾，王爱华，苏小庚，等.猪瘟病毒胶体金免疫层据检测方法的建立及应用J.中国兽医科技，2007-6.6 杨林，赵德明，熊永忠.猪瘟诊断技术的研究进展J.畜