《分子生物学实验》

1、分 子 生 物 学实 验 指 导 书安徽农业大学生命科学学院遗传教研室二00三年元月前 言随着生命科学的发展，分子生物学技术已渗透到生命科学的各个研究领域，因而分子生物学实验技术也成为高校生物学及其相关学科专业学生应该了解和掌握的技术。过去在高校生物技术等本科专业开设分子生物学实验多以质粒DNA为材料，且往往与基因工程操作技术内容有重复。近年来，基因组学研究的进展，特别是与生物学研究和应用密切相关的分子标记技术越来越广泛地得到应用，而这些技术是建立在基因组DNA分子操作和分析技术之上的，这就迫切需要学生了解基因组DNA分子操作技术，所以本实验系统在内容和体系上进行改革，以植物基因组DNA为对象

2、，建立一套基因组DNA提取、检测、扩增、酶切、杂交和特异片段回收等常用分子生物学实验技术，一方面避免与基因工程内容的交叉重复，更重要的是帮助学生了解和掌握生物基因组DNA基本的分子操作技术，以拓展和更新实验内容，提高学生动手能力和创新意识。 目 录实验一 植物基因组DNA的提取 3实验二 植物基因组DNA的鉴定 4实验三 植物基因组DNA的酶切、电泳及转膜 6实验四 Southern杂交 8实验五 随机PCR扩增反应与RAPD分析10实验六 特定片段的分离回收与纯化 12附 录 各种试剂和缓冲液的配制 14主要参考文献 15 实验一 植物基因组DNA的提取一、 原理及目的基因组DNA的提取通常

3、用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。当加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此提取基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿的抽提、混匀操作要温和，以保证得到较长的DNA片段。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带有合适末端的有效片段很少，而进

4、行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物和微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获取可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此对富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以玉米嫩叶为材料，用SDS法提取基因组DNA。二

5、、 设备液氮罐，微量移液器，台式离心机，恒温水浴锅，研钵，7ml离心管等。三、 试剂1. 提取缓冲液：100mmol/L TrisCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl、1.5% SDS。2. 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）3. TE缓冲液：10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）4. 其他试剂：液氮，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇，3mol/L NaAc（pH5.2）。四、 操作步骤1. 在7ml离心管中加入2ml提取缓冲液，60水浴预热。2. 取玉米幼叶0.51g，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，摇动混

6、匀，60水浴保温3060min（时间长，DNA产量高），不时轻轻摇动。3. 加入2ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置510 min，使水相和有机相分层。4. 室温下5000rpm离心5 min。5. 小心移取上清液至另一7ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6. 用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净的吸水纸上吸干，放入含200l TE的离心管中。若絮团太少，亦可直接在室温下5000rpm离心5 min，去除上清液，再加入200l TE溶解沉淀。7. 加入1l RNaseA (10g/l), 37水浴保温

7、30 min, 除去RNA (RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。8. 加入1/10体积（约20l）的3mol/L NaAc及二倍体积（约400l）预冷的无水乙醇，混匀，-20放置20 min左右。9. 室温下5000rpm离心5 min。10.去上清，用1ml 70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀自然干燥后，重新加入200l TE溶解，-20贮存，备用。五、注意事项1. 分离的DNA质量由它的长度和纯度决定，为获得较长的DNA片段，应轻轻操作DNA溶液，快速冷冻植物组织以减少机械剪切力和核酸酶的切割。2. 细胞裂解不完全，会导致DNA含量低，故应使用新鲜配制的裂解液，适当延长裂解

8、时间来保证细胞裂解的效果。3. 若DNA中含有蛋白质和RNA污染，可通过增加酚抽提的次数和效率来降低污染率。4. 多糖和碳水化合物是植物DNA抽提中的主要污染物，幼嫩组织多糖含量较少。植物在暗处放置13天能减少组织中的淀粉和碳水化合物的含量。实验二 植物基因组DNA的鉴定一、 原理及目的琼脂糖凝胶电泳技术是分离鉴定和纯化DNA最常用的标准方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，琼脂糖凝胶适用于分离大小在200bp至50kb范围内的DNA片段。凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之浓度越低，孔隙越大，其分

9、辨能力也就随之减弱。凝胶电泳的原理较简单，我们知道当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。当凝胶中带负电荷的DNA分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，凝胶中的溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）就会插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块可直接在紫外灯照射下拍照，

10、只需510ng的DNA就可从照片上鉴别出来，并且通过凝胶成像系统可精确地测得样品的浓度。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移率与DNA分子量的大小、琼脂糖浓度、DNA的构象、电泳时电压及电泳缓冲液的组成等有关。待测DNA样品与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知样品的分子量大小。核酸凝胶电泳常用的指示剂是溴酚蓝。溴酚蓝的分子量为670Da，在不同浓度的凝胶中，迁移速度基本相同，迁移率与0.5kb的双链线性DNA片段大致相同。电泳分离样品DNA分子时，可以参照溴酚蓝指示剂的迁移情况决定是否停止电泳。由于指示剂中含50蔗糖，所以溴酚蓝指示剂的另一个作用是增加上样DNA溶液

11、的密度，确保DNA样品沉入点样孔内。紫外分光光度计检测DNA浓度的原理在于DNA（或RNA）分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状双链、单链之间的转换，会导致吸收水平的改变，但这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但使用的紫外分光光度计较昂贵。本实验通过电泳检查、紫外检测来鉴定实验一中提取的玉米基因组DNA的浓度、纯度和质量。二、 设备电泳槽，电泳仪，微量移液器，托盘天平，微波炉，手提式紫外检测仪，紫外分光光度计，凝胶电泳成像系统等。三、 试剂1TAE电泳缓冲液，6溴酚蓝点样缓冲液，溴化乙锭（EB）贮存液（5mg/ml），琼

12、脂糖，DNA/Hind+EcoRMarkers。四、 操作步骤1. 电泳检查：（1）选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。（2）选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为1.02.0mm。（3）制备琼脂糖凝胶，根据被分离基因组DNA的大小，按0.7浓度称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，置微波炉中或电炉加热，至琼脂糖熔化均匀。（4）用透明胶带将电泳槽四周密封好，防止浇凝胶时出现渗漏。然后在凝胶溶液中加入EB（EB最终浓度为0.5微克/毫升），摇匀，待凝胶溶液冷却至50左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除去气泡。（5）待凝

13、胶冷却凝固后，小心取出点样梳并撕掉两端透明胶带，注意保持点样孔的完好。（6）在待测的DNA样品中，加1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录样品点样秩序与点样量，并以DNA/Hind+EcoRMarkers为标准点样。（7）开启电源，电压不超过5V/cm。（8）当溴酚蓝迁移约2/3距离时，停止电泳。在紫外灯下观察电泳结果，亦可用电泳凝胶成像系统拍照，判断DNA样品的分子量大小及其浓度。2. 紫外检测：取基因组DNA样品稀释至适当倍数，用紫外分光光度计测定波长260nm、280nm处的读数，同时对DNA进行200nm400nm波长范围的扫描。根据OD260/OD280比值判

14、断DNA质量，DNA纯品的OD260/OD280比值为1.8，若样品中污染有蛋白质或酚，其比值将明显低于此值。若比值大于2.0，则为RNA污染。在260nm的波长下，OD值为1相当于大约50g/ml的双链DNA，因此，根据DNA样品在260nm的读数可计算DNA样品的浓度。DNA样品的浓度按下式计算： （g/ml）= OD26050稀释倍数五、 注意事项1. 电泳点样操作的好坏与电泳结果关系密切，点样前应将样品与上样体积1/5的溴酚蓝指示剂混合均匀后点样。2. 紫外灯对人的皮肤和眼睛有照射损伤，要避免灯直接照射到皮肤和眼睛。3. EB是强诱变剂，操作时要戴手套。实验三 植物基因组DNA的酶切、

15、电泳及转膜一、 原理及目的DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制片段长度多态性）已被广泛应用于基因组图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确定生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种和不同种基因组DNA的克隆，它们位于染色体

16、的不同位点，从而可以作为一种分子标记，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因而通过杂交可获得不同类型和数量的分子标记。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。此外，当检测某个基因在基因组中的拷贝数或外源基因在基因组中的整合情况时，一般采用Southern杂交来检测。同样也要用不同的限制性内切酶对植物基因

17、组DNA进行消化，消化既可以是单酶切，也可以是双酶切或多酶切。选择被检测的基因内部无消化位点的酶进行消化，酶切后应产生被检测的DNA片段，通过杂交即可获得足够的信息。本实验将利用实验一提取的基因组DNA为样品，学习基因组DNA的酶切、电泳分离酶切片段及其转膜。二、 设备电泳槽，电泳仪，微量移液器，恒温水浴锅，白瓷盘，玻璃板，吸水纸，硝酸纤维素滤膜，滤纸，1.5ml eppendorf管等。三、 试剂1. 限制性内切酶（EcoR、Past）及10酶切缓冲液2. 变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl3. 中和液：1 mol/L TrisCl（pH8.0），1.5 mol/

18、L NaCl4. 其它试剂：0.2 mol/L HCl，20SSC，5mg/ml溴化乙锭四、 操作步骤1. 基因组DNA的酶解（1）大片段DNA由实验一提取，要求提取的DNA分子量大于50kb，没有降解。（2）在50l反应体系中进行酶切反应：5g基因组DNA5l 10酶切缓冲液20单位限制性内切酶（任意一种）加ddH2O至50l （3）轻微震荡，离心，37反应过夜。（4）取5l反应液，0.8琼脂糖凝胶电泳观察酶切是否彻底，完全酶切的产物在泳道应呈现均匀的弥散状，如果靠近点样孔附近有一条明显亮带，说明酶切不完全。2. 转膜（1）将上述酶解的DNA在0.8琼脂糖凝胶中电泳过夜。（2）500ml水中

19、加入50l溴化乙锭（5mg/ml），将凝胶放置其中染色30min。（3）依次用下列溶液处理凝胶，并轻微摇动：500ml 0.2mol/L HCl洗脱嘌呤10min，倾去溶液。用蒸馏水清洗数次，倾去溶液；500ml变性溶液处理两次，每次15min，倾去溶液；500ml中和溶液处理30min。（4）戴上手套，预先将硝酸纤维素膜、滤纸浸入20SSC溶液中。将一玻璃板架于白瓷盘中，板上铺一层滤纸，两端完全浸没在盘内20SSC溶液中，排除玻璃板与滤纸间的气泡，然后将胶块反转放置，右下角作一记号，盖上硝酸纤维素膜，上覆两层滤纸（注意：上述各层之间均不得有气泡产生）再加盖约10cm厚的吸水纸，上压半公斤重物

20、，静置18-24h，使其充分转移。其间换吸水纸1-2次。（5）取出滤膜，在2SSC中洗5min，晾干后在80中烘烤2h。至此，使DNA固定于硝酸纤维素膜上。此膜即可用于下一步的杂交反应。 五、 注意事项1. 酶切反应操作中，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性并全部放入反应体系中。2. 要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip要从溶液表面吸取，以防Tip沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20冰箱，防止限制性内切酶的失活。3. 凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（eppendorf管，T

21、ip等），都要新的，用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，严防手上杂酶污染。4. 转膜后在紫外灯下观察凝胶中是否仍有溴化乙锭发出的荧光，若有说明转移不完全。脱嘌呤不完全，洗水纸没有经凝胶而直接吸入转移缓冲液，缓冲液不足，转移时间不够长等都是导致转移失败的常见原因。实验四 Southern杂交一、 原理及目的Southern杂交是分子杂交中的一种，它是根据两条单链DNA中互补碱基序列能专一配对的原理，检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，可用于特异DNA的检测和RFLP的分析，它包括下列步骤：（1） 酶切DNA，凝胶电泳

22、分离酶切片段，然后使DNA原位变性。（2） 将DNA片段转移到固体支持物上（这两个步骤即为实验三）。（3） 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。（4） 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。（5） 通过自显影检查目的DNA所在的位置。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后，Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32P标记的高比活性探针（109cpm/g）的互补DNA。最常用的探针为双链DNA探针。

23、探针必须经过标记，以便示踪和检测。本实验的探针标记物为同位素32P，其标记方法为随机引物合成法，即使寡聚核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。二、设备高速台式离心机，恒温水浴锅，杂交箱，杂交管，X-光片，放射自显影盒，盖革计数器，-70冰箱，待标记的DNA片段，1.5ml eppendorf管等。三、试剂1. 随机六聚体引物。2. 10随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES（pH6.6）；100mmol/L MgCl2。3. 未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液各5mmol/L。4. -32PdATP：比活性3000Ci/mmol，10

24、Ci/l。5. 缓冲液A：50mmol/L TrisCl (pH7.5)；50mmol/L NaCl；5mmol/L EDTA（p8.0）；0.5 SDS。6. Klenow片段。7. 20mmol/L DTT、0.1 SDS。8. 50Denhardts溶液：5g Ficoll400、5g PVP、5g BSA加水至500ml，过滤除菌后-20储存。9. 预杂交液：6SSC、5Denhardts、0.5 SDS、100g/ml鲑鱼精子DNA、50甲酰胺。10. 杂交液：预杂交液中加入变性探针即为杂交液。四、操作步骤1. 探针标记（1）200ng双链DNA（1l）和75ng随机引物（1l）置于

25、eppendorf管中混合后水浴煮沸5min，立即置于冰浴中1min。（2）与此同时，在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管中迅速混合下列化合物：20mmol/L DTT 1l未标记的dNTP溶液 1l10随机标记缓冲液 1l-32PdATP（比活性3000Ci/mmol，10Ci/l） 3lddH2O 1l（3）将步骤（1）eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中。（4）加入5单位（约1l）Klenow片段，充分混合，离心机甩一下，使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温316h。（5）反应液中加入10l缓冲液A，将放射性标记探针保存于-20下备用。2. 预杂交、杂交、自显影（1

26、）将实验三转移的滤膜用6SSC湿润后，放入含610ml预杂交液的杂交管中，在65温度下预杂交12h，弃去预杂交液。（2）将放射性同位素标记探针煮沸变性5min，迅速置于冰上数分钟。（3）在预杂交液中加入探针，混匀。如步骤（1）将混合液注入杂交管中，再与预杂交相同温度下杂交612h。（4）取出滤膜，依次用下列溶液处理，并轻轻摇动：在室温下1SSC/0.1 SDS，15min，两次。在杂交温度下，0.25SSC/0.1 SDS，15min，两次。（5）空气干燥滤膜，然后在X光片上曝光。通常在-70曝光12天。（6）将X光片从暗盒中取出，进行显影、定影、冲洗和晾干，即可阅读杂交DNA谱带。五、注意事

27、项1. Southern杂交过程很长，涉及多个具体步骤，每一步骤的结果直接影响后续实验，所以一定要保证每步准确无误，否则将导致没有杂交信号或信号太弱。2. 32P为放射性同位素，对人体有严重伤害，操作时要小心，严防污染。 实验五 随机PCR扩增反应与RAPD分析一、 原理及目的PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法。它包括3个基本步骤：1. 变性：目的双链DNA片段在94下解链；2. 退火：寡核苷酸引物在3555温度下与模板上的同源序列通过碱基配对；3. 延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以基因组DNA为模板进行

28、合成。由这3步组成一轮循环，理论上每一轮循环将使DNA扩增一倍，而新合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经过2535轮循环就可使DNA扩增百万倍。运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段即为RAPD（randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA）。RAPD技术检测DNA多态性具有快速简便的特点，该技术建立在PCR技术基础上，利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

29、RAPD所用的一系列引物DNA序列是随机排列的，但对于任一特异引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板上有互补碱基就可扩增出DNA片段。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测，即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大，虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA

30、进行多态性检测。本实验利用10bp的随机引物，对玉米基因组DNA进行PCR扩增反应，学习初步的RAPD技术。二、设备PCR扩增仪，微量移液器，台式离心机，电泳仪，电泳槽，冰盒，0.5ml eppendorf管等。三、试剂1. 随机引物（10bp）（4mol/L）2. Taq DNA聚合酶（3U/l）3. 10buffer4. MgCl2（25mmol/L）5. dNTPs（10mmol/L）模板DNA（50ng/l），矿物油等。四、操作步骤1. 在25l反应体系中，加入10buffer 2.5ldNTPs 0.5lMgCl2 2lTaq DNA聚合酶 0.8l随机引物 2.5l模板DNA 1.

31、7lddH2O 15l 短暂离心后，加一滴矿物油（若为带热盖的PCR仪，此步可省略）。2. 94预变性5min，然后循环：94变性30sec，36退火45sec，72延伸2min，共40个循环，最后72保温10min，4贮存备用。3. 取PCR反应液8l，于1.4%琼脂糖凝胶上电泳。4. 电泳结束，紫外灯下观察、拍照。五、注意事项为获得良好的PCR结果，一般需要优化PCR反应条件，改变的参数主要包括MgCl2浓度、退火温度、模板DNA的浓度及反应循环次数。通过优化上述条件，可极大地提高PCR的敏感性、特异性和产量。实验六 特定片段的分离回收与纯化一、原理及目的在含有各种不同大小的DNA混合物中

32、（如PCR的扩增产物），分离纯化特定分子量的DNA片段，是分子生物学实验的基础工作。凝胶电泳分离回收DNA片段，是实验中最常用的方法。本实验介绍两种在普通水平式琼脂糖凝胶上通过电泳分离，然后再提取凝胶中DNA进行回收的方法。其中低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法是把所需要的DNA片段转移到低熔点琼脂糖凝胶块中，利用这类凝胶纯度高熔点低的特点，从中分离得到你所需要的DNA片段。而玻璃粉末洗脱法则利用琼脂糖凝胶溶于NaI，其中的DNA可专一性地与玻璃粉末结合，经洗涤除去杂质后，再用低盐洗脱液从玻璃粉末上将DNA洗脱下来，达到回收DNA片段的目的。二、设备电泳仪，电泳槽，台式离心机，微波炉，恒温水浴锅，手提

33、式紫外检测仪，手术刀，1.5ml eppendorf管等。三、试剂1. 琼脂糖，低熔点琼脂糖，EB贮存液。2. 20mmol/L TrisCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA缓冲液。3. 饱和酚，酚/氯仿（1：1），氯仿/异戊醇（24：1）。4. 乙醇清洗缓冲液：10 mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，50%乙醇（pH=7.5）5. 3mol/L NaAc，6 mol/L NaI，玻璃粉悬液，TE缓冲液，TAE电泳缓冲液，无水乙醇，70%乙醇。四、操作步骤(一)低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法1. 先灌制普通凝胶，然后在离加样孔适当距离处切

34、下一定大小的凝胶块，用同样浓度的低熔点琼脂糖凝胶填充，凝胶中含0.5g/ml溴化乙锭。2. 将待分离的DNA样品（PCR扩增产物）上样电泳，当感兴趣的DNA片段迁移至低熔点凝胶内，停止电泳。3. 在手提式紫外检测仪下，用手术刀切下含所需DNA片段的低熔点凝胶，放入1.5ml eppendorf管中。4. 加入凝胶条5倍体积的20mmol/L TrisCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA缓冲液，65水浴中加热510min融化凝胶。5. 等降至室温时，加入等体积的饱和酚，强烈震荡混匀20sec，8000rpm离心5min，吸取含DNA的上层水相至另一1.5ml eppendorf管中。6.

35、 加入酚：氯仿（1：1），震荡混匀，8000rpm离心5min，吸出上层水相至另一1.5ml eppendorf管中。7. 再加入氯仿/异戊醇（24：1），震荡混匀，8000rpm离心5min，吸出上层水相至另一1.5ml eppendorf管中。8. 加入1/10体积的3mol/L NaAc和二倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，-20放置30min，12000rpm离心20min。9. 弃上清，用70%乙醇漂洗沉淀，自然干燥后，溶解于10l TE缓冲液中。10. 电泳检查DNA片段。（二）玻璃粉末洗脱法1. 将待分离的DNA样品上样电泳，当DNA片段完全分开后，停止电泳。2. 在长波长紫外检测仪

36、下观察凝胶，切下含所需DNA带的琼脂糖凝胶条，将胶放入预称重的1.5ml离心管中。3. 每0.1g凝胶加入200l NaI溶液。4. 于50温育离心管510min，直至琼脂糖完全融解。5. 每5g（不足5g，以5g计）DNA加入5l玻璃粉悬液，轻轻颠倒混匀，冰上放置10min，使DNA结合在玻璃粉上。6. 室温下离心20s，收集结合有DNA的玻璃粉。7. 弃上清，加700l乙醇洗液，轻轻抽吸，使玻璃粉悬浮。冰上放置5min。8. 重复6.7步两次，室温下离心10s。弃上清，小心去除全部残液。9. 加2050l TE，轻轻吹打悬浮玻璃粉，于50温育10min，将DNA洗脱下来。10. 室温下离心

37、10s，吸取上清至一新0.5ml离心管。11. 电泳检查DNA片段。五、注意事项1. 从琼脂糖凝胶上切下DNA胶条的体积最好与DNA区带大小相似，越小越好。2. DNA的回收率与DNA片段的大小有关，DNA分子量越大，回收率越低。DNA片段的含量与回收率也有密切关系，量越少回收率越低，回收时可尽量提高DNA上样量。3. 用较小体积配制低熔点胶溶液时，容易由于水分的蒸发而导致胶浓度比预计的大。附录 各种试剂和缓冲液的配制1. 10mol/L NaOH溶液称取氢氧化钠（分子量40）80克，先用160毫升重蒸水搅拌溶解后，再加重蒸水定容至200毫升。2. 500mmol/L EDTA（pH8.0）溶液称取EDTAa2（乙二胺四乙酸二钠，分子量372.24）18.6克，先用70毫升重蒸水，加10毫升10mol/L NaOH溶液，加热搅拌溶解后，再用10mol/L NaOH溶液调pH至8.0，加重蒸水定容至100毫升，103.4kPa灭菌20分钟。3. 20 SDS溶液称取固体SDS（十二烷基硫酸钠，分子量288.44）20克，加70毫升重蒸水于42水溶解，加重蒸水定容至100毫升。4. 3mol/L NaAc溶液称取无水乙酸钠（分子量82.03）123.04克，