一种跨膜蛋白——闭锁蛋白的研究现状

1、一种跨膜蛋白闭锁蛋白的研究现状第24卷第3期2004年6月国外医学?生理,病理科学与临床分册foreign.medicalsciences?sectionofpathophysiologyandclinicalmedicinevo1.24jun.no.32oo404mcintoshjc,mervin?blakes,connere,eta1.surfactantproteinaprotectsgrowingcellsandreducestnf?alphaactivityfromlps?stimulatedmacrophagesj.amjphysiol,1996,271(2pt1):l3l0.3l

2、9.05kumarar,snyderjm.differentialregulationofsp?aiandsp?a2genesbycamp,glu.cocorticoids,andinsulinj.amjphysiol,1998,275(6pt1):l1078?1088.06yanot,masonrj,pant,eta1.kgfregulatespulmonaryepithe?lialproliferationandsurfactantproteingeneexpressioninadultratlungj.amjphysiollungcellmolphysiol,2000,279(6):ll

3、】46.1】58.07vayryneno,glumoffv,hallmanm.regulationofsurfactantproteinsbylpsandproinflammatorycytokinesinfetalandnewbomlungj.amjphysiollungcellmolphysiol,2002,282(4):i暑03.8l0.08korthagentr,surfactantproteina(sp?a)?mediatedbacterialclearance.sp?aandcysticfibrosisj.amjrespircellmolbiol,2001,25(6):668-67

4、2.09awasthis,coalsonjj,crouche,eta1.surfactantproteinsaanddinprematurebaboonswithchroniclunginjury(bronchopulmo-narydysplasia).evidenceforaninhibitionofsecretionj.amjrespircritcaremed,1999,160(3):942-949.10takahashih,kurokiy,tanakah,eta1.serumlevelsofsurfaetantproteinsaanddareusefulbiomarkersforinte

5、rstitiallungdiseaseinpatientswithprogressivesystemicsclerosisj.amjrespircrit一种跨膜蛋白caremed,2000,162(1):258?263.11gosskl,kumarar,snyderjm.sp?a2geneexpressioninhumanfetallungairwaysj.amjrespircellmolbiol,1998,19(4):6l3_621.12duttonjm,gosskl,khubchandanikr,eta1.surfactantproteinainrabbitsinusandmiddleea

6、rmucosaj.annotolrhinollar-yngol,1999.108(10):915-924.13eliakimr,goetzgs,rubios,eta1.isolationandcharacterizationofsurfactant.1ikeparticlesinratandhumancolonj.amjphysi?ol,1997,272(3pt1):g425-434.14madsenj,tornoei,nielseno,eta1.expressionandlocalizationoflungsurfactantproteinainhumantissuesj.amjrespir

7、cellmolbiol,2003,29(5):591-597.15alcomjl,hammerre,graveskr,eta1.analysisofgenomicre?gionsinvolvedinregulationoftherabbitsurfactantproteinageneintransgenicmicej.amjphysiol,1999,277(2pt1):l349?361.16hillsba,mondsmk.deficiencyoflubricatingsurfactantliningthearticularsurfacesofreplacedhipsandkneesj.brjr

8、heumatol,1998,37(2):143?147.17macneillc,umsteadtm,phelpsds,eta1.surfactantproteina,aninnateimmunefactor,isexpressedinthevaginalmucosaandispresentinvaginallavagefluidj.immunology,2004,111(1):9l-99.闭锁蛋白的研究现状邵立健综述朱清仙审校(江西医学院人体解剖学教研室,江西南昌330006)摘要:紧密连接存在于上皮细胞的连接复合体中,有屏障功能和保持细胞极性的作用,已证实闭锁蛋白,claudin和jam位于

9、紧密连接处,其中闭锁蛋白在维持紧密连接的功能方面有重要作用.闭锁蛋白与质膜下蛋白有密切的联系,其功能受到多方面因素的调控.关键词:紧密连接;闭锁蛋白;上皮细胞;zo?1;zo?2中图分类号:r318.04文献标识码:a文章编号:1001?1773(2004)03-0263-04紧密连接主要存在于上皮细胞,内皮细胞间的连接复合体中,使相邻细胞膜紧靠在一起,形成环绕细胞的物理屏障结构,具有封闭上皮细胞间隙,防止可溶性物质从细胞一侧扩散到另一侧的屏障功能,同时它把上皮细胞分成顶侧的脂质成分和基侧的蛋白质成分两个不同的功能区.紧密连接形成的屏障在不同上皮细胞间通透性不一,且这种屏障功能受到多种方式的调

10、控,这与紧密连接的分子结构密切相关.近年来,几种紧密连接蛋白成分相继被证实,如闭锁蛋白,claudin和紧密连接粘附分子(jam)等,但对于它收稿日期:2003.1】.18修回日期:2004-02,25作者简介:邵立健(1974.)男,汉族,都昌县人,江西医学院在读博士,主要从事肠粘膜屏障结构和功能的研究.263第3期国外医学?生理,病理科学与临床分册第24卷们的功能及其调节目前研究尚少.其中已证实闭锁蛋白是封闭相邻上皮细胞,内皮细胞之间间隙的重要成分,闭锁蛋白与质膜下蛋白有密切的联系.1闭锁蛋白的结构及其定位1.1闭锁蛋白的结构1993年furuse等用来自鸡肝的富含细胞紧密连接抗原成分制作

11、单克隆抗体,免疫金标记电镜观察证实此蛋白质是准确定位于紧密连接部位的分子量为65kd的蛋白质.闭锁蛋白由504个氨基酸组成,包括4个跨膜区,一个长的羧基末端胞浆区,一个短的氨基末端胞浆区和两个细胞外环,其中第一个胞外环上有高含量的酪氨酸(25%)和甘氨酸(36%),其意义还不清楚.闭锁蛋白胞浆内羧基末端约有255个氨基酸组成,它与质膜下蛋白如zo.1,zo-2,zo.3等结合【,.第四个跨膜区对于闭锁蛋白准确定位于紧密连接起着重要作用,若第四个跨膜区的丢失将会导致闭锁蛋白的羧基末端错位到细胞外间隙j.对人,小鼠,袋鼠,鸡和狗的闭锁蛋白cdna进行测序,发现人,鼠,狗的闭锁蛋白cdna序列约90

12、%同源,表明哺乳动物的闭锁蛋白在进化上有一定的保守性.鼠和狗等哺乳动物已成为人们研究闭锁蛋白的良好模型.1.2闭锁蛋白的定位闭锁蛋白准确定位于紧密连接处,有学者观皮细胞之间有密封垫样结构,将胆汁与血液隔开.另外,在上皮源性mdck单层细胞之间也可见密封垫样结构,封闭细胞之间的间隙.wu等_6j用免疫电镜证实闭锁蛋白位于睫状上皮和虹膜血管内皮细胞之间的紧密连接部位,推测其是正常兔眼的血.房水屏障的组成部分之一.2闭锁蛋白的功能hirase等_5j证实内皮细胞间紧密连接上的闭锁蛋白表达水平存在组织分布的不均一性,在脑内皮细胞,闭锁蛋白呈高表达,而在非神经组织的内皮细胞为低表达,同时还观察到闭锁蛋白

13、的表达量在发育过程中增加,以维持紧密连接的功能.当闭锁蛋白在昆虫sf9细胞中过度表达时,在胞浆囊泡结构内形成特征性多板层小体,并有短的紧密连接线样结构.mc-carthy等_2j观察到在mdck细胞高表达鸡闭锁蛋白后,跨上皮电阻(ter)在用诱导剂诱导闭锁蛋白表达5h后逐渐上升,至31hter还高出正常水平的30%40%,同时增加了紧密连接线的数量.sakakibara等l6j发现高度磷酸化(丝氨酸残基和苏氨酸残基磷酸化)的闭锁蛋白选择性聚集在紧密连接区,而无磷酸化残基或磷酸化残基少的闭锁蛋白则分布在细胞的264基侧,提示闭锁蛋白磷酸化与紧密连接的组装有关,这是否表明细胞内有一个闭锁蛋白的贮库

14、呢?有关残基磷酸化的具体位置以及这些残基磷酸化受何种因素的调节尚不清楚.wong等j证明高分子量的闭锁蛋白即高度磷酸化的闭锁蛋白是闭锁蛋白参与紧密连接组成的功能形式.表明闭锁蛋白特别是磷酸化的闭锁蛋白对于紧密连接的形成发挥着一定作用.紧密连接有屏障功能和保持细胞极性的功能,闭锁蛋白在保持紧密连接这两个功能上有多大作用呢?balda等用基因工程技术诱导闭锁蛋白在mdck细胞内过度表达,发现ter升高,细胞间的通透性降低.闭锁蛋白被转化到成纤维细胞后,观察到本来无闭锁蛋白的成纤维细胞在细胞连接处表达闭锁蛋白,并发现成纤维细胞间的黏附性更强.为了阐明闭锁蛋白的作用,有学者把敲除了羧基末端的闭锁蛋白导

15、人细胞,使ter下降,对小分子物质的通透性升高,即紧密连接的屏障功能减弱,另有学者j把敲除了氨基末端和细胞外环的闭锁蛋白导人细胞,引起ter下降,同时提高了荧光示踪剂的通透性.这提示闭锁蛋白在维持细胞间的通透性,保持细胞间的跨上皮电阻有重要意义.fallon等【j用病理模型也证明了这一点,他们发现胆总管结扎后闭锁蛋白的表达和定位均发生明显变化,在胆总管结扎2d后,闭锁蛋白的表达水平下降50%,9d恢复正常水平,还观察到胆总管结扎后,闭锁蛋白染色呈不连续性,紧密连接的通透性发生改变.takakuwalj等发现胆总管结扎后6h,闭锁蛋白mrna水平明显升高,但未观察胆总管结扎后更长时间闭锁蛋白的变

16、化,表明在急性损伤早期高表达,保护胆总管内皮,随着时间延长,其表达下降.用间接免疫荧光法观察到细菌感染后引起呼吸道上皮细胞闭锁蛋白量下降,当蛋白量开始降低时,上皮细胞紧密连接及其细胞结构病变不明显,但当蛋白量明显降低时,上皮细胞和紧密连接均发生明显的形态学损伤【j.youakim等lj在细胞水平上观察到干扰素减弱上皮细胞的屏障功能是通过减少闭锁蛋白和zo-1的表达来实现的,提示在病理条件下闭锁蛋白的变化要早于紧密连接形态学上的变化.闭锁蛋白不仅在维持细胞间的屏障功能上发挥重要作用,而且其表达水平与肿瘤的分化程度有关.在子宫内膜肿瘤,随着肿瘤恶性程度的加重,闭锁蛋白的表达相应减少,在直肠肿瘤_2

17、,分化程度高,闭锁蛋白的表达增加;闭锁蛋白的表达水平与胃癌的分化水平呈正相关.第3期邵立健,等:一种跨膜蛋白闭锁蛋白的研究现状第24卷3闭锁蛋白与zo-1.zo-2的关系与紧密连接有关的质膜下蛋白主要有zo一1,zo-2等,.zo一1,zo-2共同结合到一分子量为130kd的蛋白质上.zo一1氨基端直接结合到闭锁蛋白羧基端,且zo一1也与细胞内骨架蛋白如血影蛋白结合,这表明zo一1在紧密连接与细胞内相连中起着桥梁作用,它把闭锁蛋白和细胞内骨架蛋白连接起来,zo.1不仅表达于紧密连接,而且表达于粘附连接,但zo-2仅表达于紧密连接.从结构上看,zo.1,zo-2均为膜结合鸟苷酸激酶家族的成员,其

18、羧基末端都富含脯氨酸残基,pdz结构域和sh3结构域_】.zo.1,zo-2的pdz结构域在胞膜下提供支架来结合各种蛋白质,sh3结构域在许多骨架蛋白和信号蛋白中均存在,在亚细胞水平直接介导蛋白质与蛋白质相结合形成蛋白质复合物.目前,pdz结构域的蛋白配体和sh3结构域的结合伴侣还未知.胆总管结扎后9d,观察到zo.1蛋白的量升高到正常的3倍,但zo一1以线型形式定位于胆总管上皮细胞,这时闭锁蛋白不连续地存在于紧密连接j,这表明zo一1对紧密连接的定位有重要作用.4闭锁蛋白功能的调节闭锁蛋白在维持紧密连接的功能中发挥着一定的作用,但其其结构,位置的变化受到多种因素的调节,如:蛋白激酶c(pkc

19、),ca,rho激酶,酪氨酸激酶系统等.4.1蛋白激酶cpkc是一类依赖于can,甘油二酯或磷脂酰丝氨酸刺激而激活,催化蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的蛋白激酶,是细胞肌醇磷脂信号通路的关键环节.在机体细胞生长分化,血管平滑肌收缩及凋亡中起着重要作用.pkc是至少由12种以上同工酶组成的超家族.由不同刺激如血管紧张素,血管加压素,肾上腺素引起胞内ca浓度升高,导致细胞间隙通透性增加,这种作用可被pkc抑制剂所抑制.低ca2条件下的mdck细胞,加入pkc激动剂dag或佛波酯可引起闭锁蛋白快速磷酸化,形态学可观察到闭锁蛋白朝着细胞间隙移位,但这种作用可被pkc抑制剂所阻断,进一步分析磷酸化位置发

20、现小鼠闭锁蛋白的羧基末端的338位的丝氨酸被pkc磷酸化_l.在同样条件下,balda等用dag后可观察到zo.1朝质膜运动.这证实pkc涉及到闭锁蛋白功能的调节,在低钙条件下,pkc引起闭锁蛋白磷酸化促进紧密连接的形成,降低细胞间的通透性.还有实验观察到紧密连接的265组装过程中,蛋白质的磷酸化起着重要作用,pkc是紧密连接正确组装所需的一种成分,低浓度的pkc抑制剂明显抑制了跨上皮电阻(ter)的形成,这是与延迟zo一1定位于紧密连接(tj)同步_】,说明zo一1可能是pkc的另一靶标.在对tj通透性进行调节的许多信号转导途径中,pkc起着重要作用,用pkc激动剂后,观察到tj通透性升高,

21、pkc可引起tj蛋白磷酸化(包括闭锁蛋白),闭锁蛋白的磷酸化有利于tj的组装.使用pkc激动剂后,其下游的激酶或磷酸化酶激活,导致已磷酸化的闭锁蛋白去磷酸化,引起tj通透性升高2o3.有学者把突变的pkc导人细胞,诱导其过度表达,观察到细胞间的通透性和细胞极性均被破坏_2l_,这表明pkc在哺乳动物上皮细胞间连接结构的形成和细胞极性的保持中发挥着一定作用.在缺氧,低血糖等情况下,血管内皮细胞之间的通透性升高,但这种作用可被pkc抑制剂所阻断.产气荚膜杆菌毒素a的攻击引起细胞间通透性升高,实验观察到毒素a激活质膜和胞浆pkc一,pkcb,导致闭锁蛋白去磷酸化,zo-2移位,tj通透性升高,用pk

22、c抑制剂后并未观察到闭锁蛋白去磷酸化,zo-2移位_2,提示pkc作用于毒素a引起的细胞间通透性升高,闭锁蛋白,去磷酸化和zo-2移位.有学者报道用pkc激动剂tpa能提高肠上皮细胞iec一18的通透性,同时ter明显下降,pkc从胞浆向胞膜移位,其通透性升高并不伴随着紧密连接蛋白如闭锁蛋白位置的变化,而闭锁蛋白只体现了磷酸化和去磷酸化的变化.4.2肌球蛋白与连接肌动蛋白位于上皮细胞顶侧连接复合物下的肌动蛋白与肌球蛋白形成复合物结构,周围连接肌动蛋白通过结合蛋白与细胞膜结合,参与膜骨架系统的构成.实验证明2o3,顶侧肌动蛋白细胞骨架在紧密连接的功能调节上也有一定的作用,破坏细胞骨架系统后,上皮

23、细胞顶侧肌动蛋白受到损伤,同时上皮细胞通透性屏障被破坏.当胞内ca浓度升高,肌动蛋白收缩,出现顶侧肌动蛋白聚合,细胞间通透性升高.rhogtp酶可调节胞内肌动蛋白的分布,walsh等_2j证实rho激酶通过对肌动蛋白细胞骨架的调节来达到调节紧密连接,并证实tj形成过程中,rho激酶对顶侧连接蛋白和肌动蛋白细胞骨架的组织起着重要作用,用rho激酶抑制剂可抑制tj的屏障功能.这表明pkc对闭锁蛋白有双向调节作用.闭锁蛋白可调节大鼠内皮细胞间连接周围环行肌动蛋白的排列,将闭锁蛋白cdna转染内皮细胞第3期国外医学?生理,病理科学与临床分册第24卷后,在免疫电镜下可观察到环行的肌动蛋白,而未转染的内皮

24、细胞未见环行的肌动蛋白.有关紧密连接的完整分子结构及其调节机制并不十分清楚.进一步阐明在生理和病理条件下,闭锁蛋白的分布,功能,与质膜下蛋白的关系及细胞内肌动蛋白,pkc等如何对其调节,寻找是否还有其它更为重要的调节途径对紧密连接的开放有重要意义.在描述紧密连接分子构筑方面,研究报道逐渐增多,这将对细胞间的屏障结构是如何形成及其调节提出新的观点,闭锁蛋白是构成细胞间屏障的重要结构,但有关闭锁蛋白在各种病理过程中有何改变及其作用?闭锁蛋白是如何组装入紧密连接?这是否需要胞膜下蛋白的调节?质膜下蛋白的调节起着多大的作用?在细胞内是否有闭锁蛋白贮库等问题尚需进一步探讨.参考文献olbaldams,l

25、orenzagm,matterk,eta1.assemblyofthetightjunction:theroleofdiacylglycerolj.jcellbiol,1993,123(2):293302.02mccarthykm.skare1b,stankewichmc,eta1.occludinisafunctioncomponentofthetightjunctionj.jcellsci,1996,109:2287-2298.03mankertzj,wallerjs,hillenbrandb,eta1.goneexpressionofthetightjunctionproteinoccl

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