鸭源肠球菌的致病性和致病机制的研究

1、鸭源砀球菌的细跑壁蛋白鉴定和致病性的关系的研究 摘要 以临床分离的株鸭源肠球菌（郑株、郑株、郑株、北京株）和株粪 肠球菌（参考株）为研究对象，根据其部分生物学特性将各菌株鉴定到种；人工感 染雏鸭及小自鼠，比较各菌株的致病力强弱，探讨肠球菌的致病特点和致病机制； 提取各菌株的细胞壁蛋白，制备抗原、抗体，并采用，和技 术比较各菌株细胞壁蛋白的异同。借以对分离菌株进行更细致的表型分析，探讨肠 球菌的胞壁蛋白的差异性与其致病力强弱之间是否存在着关联，从而为该病的致病 机制和免疫机制的更深入研究提供理论依据。 对株鸭源肠球菌临床分离株和株粪肠球菌参考菌株的形态特征、培养特 性、生理生化特性、对药物的敏感

2、性等生物学特性进行了初步研究，旨在将这株 临床分离菌株准确鉴定到种，为以后的致病性试验和不同菌株细胞壁蛋白的比较分 析奠定基础。结果个被检菌株在光学显微镜下呈球形、革兰氏阳性染色和链状排 列方式，以及能在、和肉汤等条件下生长的特性均符合肠球菌 属的特征，各菌株生化反应特性与粪肠球菌特性基本一致，因此将这个菌株均鉴 定为粪肠球菌。药敏试验结果发现它们均对青霉素、万古霉素和庆大霉素敏感而对 四环素耐药。 复制雏鸭感染肠球菌病理模型，观察各组鸭感染后的主要临床症状和病理变 化，计算各组感染鸭的发病率、死亡率和细菌分离率；同时测定各菌株对小白鼠的 半数致死量，观察感染小鼠的主要临床症状和病理变化。旨在

3、比较不同菌株的致病 力强弱，找出高致病力菌株，揭示肠球菌的致病特点和致病机制。结果显示个菌 株对雏鸭和小白鼠均有致病性，且以北京株致病力最强，其感染雏鸭的发病率、死 亡率和细菌分离率均明显高于另外株；北京组感染鸭早于其它组出现临床症状且 症状最明显，病理变化也较其它组严重；北京株对小白鼠的明显低于其它株， 对感染小鼠的病理损伤也较其它组严重。感染鸭主要剖检变化为心包积液，心外膜 和气囊表面附着有纤维素性炎性渗出物，肝脏肿大、淤血、出血和坏死，以及脾脏 肿大等；镜下主要发现病鸭心肌出卧嘌仔韵赴笠约捌嗔馨拖赴跎俚?等。 将各菌株的 培养物离心，沉淀用溶菌酶处理后经超声波粉碎菌体细 胞，再将裂解物离

4、心，取沉淀得细胞壁制备物。该细胞壁制备物再经饱和硫酸 铵纯化即得细胞壁蛋白。采用技术分离各菌株的细胞壁蛋白，比较各菌 株蛋白图谱的异同。采用半干转印系统将分离的各抗原蛋白带转印到 膜上，与常规方法免疫家兔制备的抗北京株胞壁蛋白的抗血清进行 分折，柃测各抗原蛋白的免疫学活性。结果各菌株的细绝壁蛋白经 在分子量之间均显示十多条蛋白带；而用抗北京株胞壁蛋白血清作 华中农业大学届硕论文来检测各菌株的胞壁蛋白，则只能识别出北京株的抗原蛋白带而识别不出其它个蘸株的蛋白带，且北京株所碱测到的蛋白中以的蛋白带显色最清晰。 关键词：鸭；肠球菌；鉴定；致病性；胞壁蛋白： 鸭原肠球菌的细胞壁蛋白鉴定和致病性的关系的

5、研究 ， ， ， ， ： ， ， 。， ， ” ， ， ， ， 托 ， ， ， ， ， ? （） 正 ， ， ， ， ， ， ， ， （）（） （） ， ， ， 华中农业大学届硕论文 ， ：； 鸭源肠球菌的细日赶壁蛋白霉定和致病忭的关系的研究 过硫酸铵 菌落形成单位 ，二氨基联苯胺 双蒸水 订 ，硫代苏糖醇 乙二胺四乙酸 克 小时 苏木素一伊红 辣根过氧化物酶 免疫球蛋自 千道尔顿 千克 毫克 分钟 毫升 毫升每平方厘米 几 毫摩尔每升 溶茵酶释放蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚乙二醇 聚偏氟乙烯 每分钟转数 十二烷基磺酸钠 秒 缓冲液 一 缓冲液吐温 ， ，四甲基，胺 肉汤 微克“

6、 微升 华中农业大学学位论文独创性卢明及使用授权书 学位论文 是否保密 不 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声髓所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用迁的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 时习： 研究生签尔乔搦红 年多月”？ 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定。，目学生必须按照学校要求提交学位论

7、文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版。并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全部或部分内容注：保密学位论文在解密后适用于本授权书学位论文储豁科搀；。导黼：锈而签名日期：年岁月勿日 签名日期：印二年月日 鸭原肠球菌的细匏壁蛋白鉴定和致病性的关系的研究 第一部分文献综述 概述 禽类肠球菌病的病原，曾被划分到链球菌属的血清群中，与群的兽疫链球 菌共同构成禽类链球菌病。自上个世纪中后期，将原链球菌属群中的肠球菌群分 离出来独立成为肠球菌属（）（郁庆福，）。因此，禽类的链球菌

8、病也随之被分成了两类疾病，即链球菌病和肠球菌病。年的伯杰氏细菌学分 类手册（第九版）正式将肠球菌属列为一个独立菌属；主编的禽病学（ 年，第十一版）正式将肠球菌病从链球菌病中独立出来。 本病是由多种肠球菌感染引起的禽类的一种急性败血性或慢性传染病。病禽主 要表现为昏睡，持续性下痢，跛行或瘫痪，以及神经症状等。剖检可见皮下组织及 全身浆膜出血、水肿，实质器官如肝脏、脾脏、心脏和肾脏肿大，有点状坏死甘 孟侯，）。 禽类肠球菌病的发生情况 由于长期以来与链球菌属的兰氏抗原血清群相混淆，真正的报道肠球菌感染 的历史很短。家禽急性链球菌感染最初见于和在年和 年报道的鸡中风样败血症。长达个多月的慢性链球茵感

9、染导致鸡群的死亡率， 并且死亡原因为链球菌引起的输卵管炎和腹膜炎。年首次报道与链球菌有关的细菌性或增生性心内膜炎，和在年再次报道。年首次报道火鸡的链球菌病（，）。（）以及和（）分别报道了鸡的粪链球菌感染。和在的报道中提出证据证明粪链球菌与鸡的生长阻抑有关。（）对链球菌病进行了全面的历史性回顾。这些报道中大多数将肠球菌命名为链球菌，因此很难确证最早的报道时间。大多数早期报道的病例包括绌菌性心内膜炎和肝脏肉芽肿，偶尔有急性败血症（，）。 近几年来，该病在我国部分地区的暴发率逐年提高，给养禽业造成了严重的经济损失。年月，四某鸦场饲养的多只周龄的肉鹦暴发罕见的粪肠球菌病，发病率以上，死亡率很高（陈一资

10、等，）。顾春艳和吕燕报道，年秦皇岛市某鸡场日龄雏鸡暴发屎肠球菌病。李锡慧等年报道，云县某鸡场暴发鸡肠球菌感染造成的死亡率。李芹年报道，山东省南县某养殖户饲养的只肉鸽发生急性败血性粪肠球菌病。常洪涛等报道，郑州市某动物园孔雀暴发急性粪饧球菌病，造成的死亡率。这些报道也都沿用以前的命名而将肠球菌命名为链球菌。 华中农业大学届硕论文 病原学 肠球菌分类地位的演变及分群 现在的肠球菌属细菌在年以前被归属于链球菌属群中，其分类依据是 按照链球菌细胞壁中多糖抗原的不同将链球菌属分为、 、和群等个血清群。 随着新的细菌分类技术的应用，特别是和杂交技术的应 用，根据肠球菌的独特性、同源性研究以及细菌核蛋白体（

11、）的低聚糖 核苷酸，将原来的链球菌属分成个菌属，即链球菌属（）、肠球菌属 （）和乳球菌属（）。原链球菌属中的群肠球菌群被分 离出来独立成为肠球菌属，现在的链球菌属群中只保留了牛链球菌和马肠链球菌 （郁庆福，）。年的伯杰氏细菌学分类手册（第九版）增设了肠球菌 属（ ）共个种。年美国学者和英国学者 又先后发现个新种和个变异株，以后又对个别菌种进行了调整（郁庆福，； 张联鐾，）。因此，原禽类链球菌病中的粪链球菌（）、粪便链球菌 ）、坚韧链球菌（ ）和禽链球菌（ ）应归入肠球菌属， 分别命名为粪肠球菌（）、屎肠球菌（）、坚韧肠球菌（ ） 和乌肠球菌（ ）。 根据肠球菌利用糖类的特征可将其分为个群：群以

12、鸟肠球菌为代表，包括恶臭肠球菌、假鸟肠球菌、棉糖肠球菌和解糖肠球菌；群以粪肠球菌为代表，包括屎肠球菌、铅黄肠球菌、鸡肠球菌和芒地肠球菌等；群以坚韧肠球菌为代表，包括希拉肠球菌、殊异肠球菌等；群包括硫磺肠球菌和盲肠肠球菌；群现只有鸽肠球菌（张联嬖，）。生物学特性 本菌呈圆形或卵圆形，直径为毗，单个、成对或呈链状排列。链的长短往往与菌株的生长环境有关，一般在液体培养基中链较长，而在固体培养基上则链较短。无荚膜，不能运动，嗍薇廾恍纬裳堪妆患钚匀玖先旧锢际先旧粜裕嘌暇没虮煌淌上赴淌珊蟮木暝蜃跣裕庑欧保梗梗担海樱幔椋欤玻埃埃担?本菌为需氧或兼性厌氧菌。在普通培养基上生长不良，在含鲜血或血清的培养基上生长

13、较好（甘盂侯，）。多数菌株的适宜生长温度为，适宜的为。在血液琼脂培养基上形成灰白色，半透明，表面光滑，直径约，圆形隆起的小菌落（郁庆福，）。不同菌株可产生不同的溶血现象。本菌触酶反应阴陛，能分解葡萄糖产酸，对乳糖、阿拉伯榜、鼠李搪、甘露醇、山 鸭原肠球菌的细胞壁蛋白鉴定和致病性的关系的研究 梨醇、水杨苷、棉子耱等的分解特性因菌株而异，能在胆盐培养基上水解七叶苷。 禽源分离株中，肠球菌因能生长在的葡萄糖肉汤和肉汤中以及对 石蕊乳的强还原性而与群的兽疫链球菌（）相区别。另外，肠球 菌能在。和下发育繁殖，能耐热” 。以上几点可作为肠球菌和其 它禽源链球菌的鉴别要点（刘恭植，；郁庆福，）。 与禽类疾病

14、有关的肠球菌主要有粪肠球菌（）、屎肠球菌（正）、 坚韧肠球菌（ ）和鸟肠球菌（）。某些新分离的粪肠球菌粪亚种（ ）、粪肠球菌液化变种正卢 ）和粪 肠蚓钢窒蓿妫幔澹悖幔欤椋螅螅酰猓螅穑恚铮纾澹睿澹螅伎醋魇欠喑蚓樱幔椋欤玻埃埃担仪葜?也可分离到其它肠球菌。 表肠球菌与链球菌、乳球菌的鉴别特点（郁庆福，） 注：“”表示阳性反应；“一”表示阴性反应；“”表示阳性或阴性。：“” ；“” ；“！” 表家禽中常见肠球菌种问鉴别特性（东秀珠和蔡妙英，；，） 注：“”表示阳眭反应； “一”表示胡性反应；“”表示结果不确定；：“” ； ；” 华中农业大学届硕上论文 致病因子 链球菌的致病因子 链球菌的致病因子研究

15、较多的有荚膜多糖（）、细胞壁成分 溶菌酶释放蛋白（ ，）、细胞外蛋白因子（ ，）和溶血素（）等（张玲妮，）。 荚膜多糖曾被认为足猪链球菌型的毒力因子，其分子量为，由鼠李糖、 半乳糖，葡萄塘、乙酰葡萄糖胺和唾液酸组成，摩尔比为： （，）。荚膜多糖经弗氏不完全佐剂乳化后免疫的动物都产生调理素抗体， 在感染过程中能够抵抗巨噬细胞的吞噬作用（，），是一种重要的抗吞噬因 子（，）。在体外，与野生菌株相比，不含荚膜的菌株对肺泡巨噬细胞的敏 感性更强（张玲妮，）。 链球菌特别是猪型链球菌（）的毒性相关蛋白成为近几年来国内外研究的 重点和焦点。和等（）在比较有毒力菌株及无毒力菌株的蛋白图谱 时发现，从病猪体内

16、分离的型菌株都具有分子量为的细胞壁蛋白和分子量 的细胞外蛋白，并将他们分别命名为溶菌酶释放蛋白（）和细胞外蛋白 因子（）。 是一种细胞壁蛋白，分子量为。等于年对猪链球菌致病株的完整的基因进行了克隆，测序，结果显示此序列包括，的开放阅读框，编码个氨基酸（ ，）。因其端有一类似于群链球菌蛋白基因的锚式序列，故又称类蛋白。而具有蛋白的菌株能够抵抗巨噬细胞的吞噬作用并能黏酣上皮细胞（ ，），等因此推测其可能通过与纤联蛋白结合而与毒力有关。目前已发现蛋白类似物（）的出现（何孔旺，）。为胞外蛋白因子，分子量，仅能从培养上清中检出。进一步研究发现猪链球菌型还存在另外一种在抗原性上与相关，分子量在以上的类似物

17、（）（ ，）。两者的氨基酸序列分析表明，。在端的个氨基酸与一致，但在端两者有着明显区别。和基因序列上的差异可能导致表型为和十的菌株的致病力差异（张玲妮，）。 和与猪链球菌型致病力之间存在一定的关系，表现型菌株只存在于临床发病猪体内，而很少存在于临床健康的猪体内（何孔旺，）；人工感染猪链球菌型发现表现型菌株可引起典型的脑炎、多发性浆膜炎和关节炎，而。表现型菌株则无此致病力，从而认为和是猪链球菌的两种重要的致病因子，并可作为该菌的毒性标示物（何孔旺，）。但后来的研究发现这两种 鸭源踢球菌的螂跑壁蛋白鉴定和毁病性的关系约研究 蛋白对型菌株的致病性并非必不可少。等通过大量的研究表明，不产生 和的菌株不

18、一定是非致病株；等年报道，能引起脑膜炎的菌株表 型为，因此等认为仅靠检测和的有无来判断细菌的毒力是 不够的（ ，）。猪链球菌的毒力应该是多种因子综合作用的结果，其 中一种因子的部分功能可由另一种因子的补充来完成。此外他们还猜测这些蛋白可能 不是毒力因子，而他们的组合恰好与毒力有关（张玲妮，）。 等自年以来，一直在进行鸽子肋的致病 性与致病因子的研究。（）用和免疫印迹技术将不同血 清型的分为个表现型，”，并证明了 蛋白和为的毒性相关因子。（）研究了鸽子体内 分离的培养基悬液中的胞外蛋白，和细菌致病力的关系，并 证明了。的表现型与致病力的关系比血清型更为密切。 （）用对属于不同毒力不同生物型的株家鸽的细胞壁蛋白进行了比较分析，并揭示了分子量为、和的缅胞壁蛋 白可能为该菌的毒性标示物。 溶血素分泌于细菌培养上清中，属于硫醇激活的穿毒素家族，分子量为。根据溶血能力的不同，链球菌可分为不完全溶血（溶血），完全溶血（溶血）和不溶血（溶血）。菌株的培养上清及纯化的均具有细胞毒性作用，经胆固醇预处理可抑制毒性作用（，），在细胞水平上证明了溶血素在致病过程中的重要作用（徐淑菲，）。肠球菌的致病因子 肠球菌的致病因子目前研究的还不够深入。某些代谢产物及某些组成成分都可能与其致病力密切相关，有些毒力因子还可能影响机体的免疫功能。迄今为止人