淋球菌MtrC融合蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和特性鉴定

1、中国麻风皮肤病杂蠢生箜垫鲞箜 塑淋球菌 mtrc融合蛋 白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和特性鉴定林能兴 陈宏翔 黄长征 涂亚庭摘要 目的： 建立针对淋球菌 mtrc膜蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，制备相应的单克隆抗体 (单抗)，用于淋球菌耐药机制的研究和淋球菌耐药的临床检测。方法： 用重组 mtrc抗原免疫 6周龄balbc小鼠，按常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单抗。应用间接 eijsa法和 western印迹法分别测定单抗亚类及其特异性。结果： 建立了2株小鼠抗 mtrc单抗杂交瘤细胞 2b3和4f7，染色体数在 95103之间，能稳定分泌抗 mtrc单抗，单抗类型为 isg1，腹水效价为 1：1

2、和 1：1 。结论：本研究建立的单抗在检测淋球菌 mtrc膜蛋白时有高度特异性和敏感性。关键词 杂交瘤；单克隆抗体；淋球菌f_arlalimtmtand characterization of向 ee hybriaoma cellline 鼬删 ng monodonalantilmdy againstmtrcofneisseria gonolyhoeaeiin，chenhongxiaag，huanga ，eta1departmentofdermatology，wuhanunionhospital，medcacoege，huazhongumverstyofsc andtedmoogy ，wuha

3、n，430022【abslraet ob tive：todevelopand identifythemonoclonalantibodyagainstrecombinantmtrc antigen，inor-derto provide a rationalresearch basis for het study on quinolone resistance mechanism nda clinical detectionmethodsrecomb inantmtrc proteinwasused asntigena ot imnlunenalbc micemanoclonalntibodie

4、sa againstmtrc we糟 prepared by normal hybfidoma technologythe specifcity nda sensitvity of ntia mtrc ntibodiesa(mcabs)werecalculated accordingot hetresultsofjsa andwestern blotmethods缸：twocelinesl ofhybfidoma，with chlmosonle numbersof 95 1o3and constantly secretingmcabs，wereobtained nda named as2b3

5、and 4f，which produced specifc mcabsmcabs were isglsubclassand hettitersfo ascitic luidf welt 1：1 and1：1 respectivelycolldlll：thestablishede mcabsin this study ot detectmtrc protein fo n gonorrhoeaeposses hish specifcity nda sensitvity【keywords hybfidoma；monoclonalntibodya；neisseriagonorrhoeae维普资讯 ht

6、tp:/27l论 著 淋病是我国目前发病率最高的性传播疾病之一，由于抗生素的广泛应用及不规则用药，淋球菌的多重耐药已成为淋病防治中的一大难题。淋球菌耐药机制与 mtr系统 、青霉素酶结合蛋白 (penicilin bindingproteins，pbps)的改变及质粒耐药均有关系，有时数种机制可同时存在而产生协同作用。其中 mtr系统涉及到了大多数抗生素，包括 8一内酰胺类及氟 喹诺酮类等药。mtr外排系统 中 mtrc蛋 白在决定淋球菌的耐多种抗生素的能力中起重要作用，其合成量的增减直接决定了细菌的耐药程度 。本研 究用重组纯化mtrc蛋白作为抗原，采用鼠一鼠杂交瘤

7、技术制备了 2株分泌高效价的抗 mtrc单 抗细胞株，为进一步研究mtr外排系统的耐药机制奠定基础。基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30371293)作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤性病科，武汉，钔1 材料和方法11 材料 balbc纯系小鼠，雌性，68周龄 ，购自湖北省疾病预防控制中心。sp20骨髓瘤细胞株由同济医学院免疫实验室提供、rpmi1640培养基 、新生小牛血清、次黄嘌呤一氨基蝶呤 一胸腺嘧啶核苷(hat)、聚乙二醇 (peg4000)均购自 gibco公司；秋水仙素(华美进口分装 )；hrp标记羊抗鼠 isg购 自武汉博士德生物制品公司。12 方法121

8、 免疫原的制备 mtrc融合蛋白表达及纯化：将重组质粒以低温 cacl法转化到大肠杆 菌 de3中 ，于 ij3培养基 中 37a【=扩增过夜 ，转至另一 ij3培 养基中，再扩增 3h，以 1mmoll ig(终浓度)诱导 8h提取细菌。细菌离心沉淀经洗脱法提取包涵体 。粗提的包涵体尿素溶液用固化 ni 层析树脂纯化带有组氨酸标记的 mtrc蛋 白。采用逐步降低尿素浓度的方法除去蛋白溶液中的尿素。维普资讯 维普资讯 国麻风皮肤病杂志 2oo7年4月箜 鲞箜外排机制把药物排出细胞外，可见 ntrc蛋 白在决定淋球菌的耐

9、多种抗生素的能力中起重要作用，其合成量的增减直接决定了细菌的耐药程度。淋球菌对 has 抗性水平的改变和 mtrc蛋 白含量的改变密切相关。ntrrcde系统中任何基因的突变或缺失，或是其编码产物结构不完整，都会影响淋球菌对 has的耐受性改变 。从生态学角度来看，淋球菌外排系统可使其在不利的生存环境中提供一个生存优势。有推测认为淋球菌在泌尿生殖道等高 has的环 境中首先发生1vitrr基因突变，产生对 has中度抵抗，进而发生 1vitrr基因启动区的插入重复序列碱基缺失使其产生更高抗性。因此以淋球菌外排泵为靶目标进行干预研究，对于淋病的治疗和预防是非常有必要的。杂交瘤细胞单抗技术应用于

10、1vitr外排 系统耐药机制的研究在国内尚未见相关报道。我们以重组lvltrc为抗原免疫、融合和筛选，成功得到能持续稳定分泌抗 ntrc单抗 的杂交瘤细胞株，采用了 western blot方法检测了单抗的特异性 。实验中细胞的融合率达到 5729，融 合细胞分泌 mab 的阳性率为1455，提示重组 ntrc的免疫原性较强。下一步我们将用 ntrc及 lvltrc单抗对 ntrrcde外排 系统进行干预，从 ntrrcde外排机制分子调控水平上对其耐药机制进行深入研究。淋球菌的耐药机制除了 ntrrc de外排机制外还涉及其它数种机制，如 pbps的改变及质粒耐药机制等，因此，要彻底了解淋球

11、菌耐药机273制还有很多工作需要我们进一步去做。参 考 文 献lhag loan keshaferwm transcriptionalcontrolofthe mtrefluxsystem ofnesseria gonorrhoeaebacterioll995：177：41622吴雄文，梁智辉 实用免疫学实验技术武汉：湖北科学技术出版社，2oo22482493 i-iagman ke，pan wp， sprat bg， eta1resistance of neisseriagonorrhoeaetoantimicrobialagentsismodulated bythemtrrcde el-l

12、uxf system microbiology 1995：141：61l一6224 jerseae，sharmand，simmsan，eta1a gonococcalef1ux pumpsystem enhancesbacterialsurvivalin a femalemouse modelofgeni-taliraetinfectioninfectlmmunol2003；71(1o)：557655825alex s，daad a，jennifer l，et a11itrc，an outer memblranedecahaem c cytochrome required formetal r

13、eduction in shewanelaputrefaciensnit11iolecularmicrobiology2001；39(3)：72273o6 rouquete c，nfllmon jb，shafer wm，et a1 induedon of themtrcde encoded efllux pump system of neisseria gonorrhoeaerequireslitra，anaraclikeprotein1iolmicrobiol1999；33(3)：65l一6587vealwl，yeena，baltlazarjt，eta1lossoffunctionmutad

14、ons in themtrefllux system ofneiseria gonorhoeaemicrobiology1998；144(n 3)：62l一6278刘彦春，朱威，连石，等 淋球菌多重耐药调控子的研究进展 临床皮肤科杂志 2002；31(2)：127128(收稿：2oo60703 修回：2oo609一o1)120例脂溢性脱发患者血脂检测赵跃华脂溢性脱发为较常见的毛发疾病，严重者影响美观，其病因尚未完全阐明。为探索血脂情况与本病发病关系，我们对临床确诊为脂溢性脱发患者 120例于初诊时进行了血脂检测，现报道如下。临床资料 120例脂溢性脱发患者中经 验 交 流 表 1 120例脂溢

15、性脱发患者血脂检测结果 (露s)男 89例，女 3l例，年龄 l549岁，其中 l5(为我院检验科测正常值)相比，见表 1。关于患者皮脂溢出和血脂变化或其2o岁9例，2l3o岁70例，3l40岁28上述结果表明：病例组所测：tc、tg、代谢情况对脂溢性脱发的影响或发病问例，4l49岁 l3例。病期：l5天l1年， ldlc、rtdi一c之值均高于对照组，而题，亦倍受关注，为探索其相互关系，本文其中 l5天1年 50例 ，23年 45例，4rtdi一c值低于对照组，其差异均具有显对 120例患者作 了血脂(6项)检测，其中7年 l2例，8l1年 l3例。著性意义。i-me,一c值两组间无显著性有 5项显示 了异常 (ri、tg、ldlc、rtdlg检测血脂项目及结果：总胆固醇差异。c值均高，而 itdl一c值低于对照组)，(ri)，甘油三酯 (tg)，低密度脂蛋白(ldl讨论 脂溢性脱发，在男性称为男性本结果提