elisa操作步骤 花板 假阳性

1、elisa操作步骤 花板 假阳性ELISA操作步骤及花板问题一、试剂盒的组成1酶标板2阳性对照3阴性对照4酶结合物5洗涤液6显色剂A 7显色剂B8终止液9封板纸10说明书11样品稀释液（HCV）二、方法原理1双抗原夹心法HIV HCV2双抗体夹心法HBV（两对半：HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc）大三阳：HBsAg、HBeAg、抗Hbc（传染性强）小三阳：HBsAg、抗HBe、抗Hbc（传染性弱）三、操作步骤HBsAg1配液：将浓缩洗涤液（30、50ul）20X用蒸馏水或去离子水稀释（600、1000ul）。2编号：将样品对应微孔按序编号。3加样：分别在相应孔中加入待测样品

2、。垂直加液，不能滴在孔壁上。（样品：人份/枪管）4加酶：每孔加入酶标试剂，轻轻振荡均匀。垂直加液，不能滴在孔壁上。5温育：用封板纸封板后放入恒温箱37度温育30分钟。6洗涤：手工：甩去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干；机洗：洗板5次，浸泡3060秒，洗板完毕后拍干。加满：防止孔口内有游离酶不那洗净。7显色：每孔加入显色剂A、B液，轻轻振荡均匀，37度避光显色十分钟。阳性孔为蓝色。8加终止液：终止液为2M硫酸。阳性孔为粉色或粉红色。9测定：用酶标仪测定，波长450nm。建议使用双波长630nm。四、防止花板、假阳性现象出现的注意事项花板：微孔中的大多数或水平方向的一整条

3、出现弱阳性。假阳性：微孔中出现个别的弱阳性。1样品应充分离心10分钟以上，使血清和血浆彻底分离；2加样时不能将纤维蛋白加入微孔中；3在进行温育前，应将板条平整放好，封板纸将各个微孔密封；4洗板机位置调节正确，不能出现有溢出现象，残留量达到要求（拍板时以点状出现，不能成片）；5加液要加满，避免使空口处残留有游离酶；6短针不能有滴液现象；长针吸液要畅通（主要问题：漏气、纤维蛋白堵孔），针管的下端面不能挂有纤维蛋白；五、可能造成假阳性现象的标本因素1内源性干扰因素（类风湿因子、补体、免疫球蛋白、异嗜性抗体、自身抗体、抗鼠Ig抗体、交叉反应物质）a类风湿因子RF：在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中

4、，常含有较高或不同浓度的RF，一般为IgM 型，也有IgA型和IgG型，RF具有与变形IgG产生非特异结合的特点。因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。b自身抗体：自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应的靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中可干扰相应抗原抗体的测定。c溶菌酶：溶菌酶可与等电点较高的蛋白有较强的结合能力。在双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。2外源性干扰因素（标本溶血、标本被细菌污染、标本贮藏时间过长、标本凝固不全）a标本溶血：血红

5、蛋白中含有血红素，其有类似过氧化物的活性，因此在以HRP作为标记酶的ELISA 测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。注：在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。b标本凝固不全：血液采集后，如果收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常在半小时后开始凝固，1824h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中，仍可以形成肉眼可看得到的纤维蛋白块，易造成假阳性的结果。因此，血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。六、工程师在用户处应注意事项1试验由专业技师完成，工程师只观不动；2在维修或处理问题时，应戴好手套；3用5针头解决堵孔问题时，千万小心不要将手指扎破；4小心用户桌上、地上的各种试管、纸盒、仪器，不要将其损坏；5如果废液瓶以满，应通知用户处理，不要自行解决；6工作时注意力集中，不要将任何液体溅到身体上；7工程师维修时应带上微孔板，尽量让用户提供费板，如用自带板，用后直接置于垃圾