发酵菌种来源

1、发酵菌种的来源与选育,第一节,菌种的来源,?,根据资料直接向有科研单位、高等院校、,工厂或菌种保藏部门索取或购买；,?,从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,从自然界筛选,自然界中菌种分离的一般过程,土样的采取,预处理,培养,菌落的选择,产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：,高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题,：,分离思路,?,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中,依照生产的要求、菌种的特性，采用各种,筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种,挑选出来。,?,实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，,也必须重新进行分离纯化。,?,有了优良的菌种，

2、还要有合适的工艺条件,和合理先进的设备与之配合。,?,定方案：,首先要查阅资料，了解所需菌种的生,长培养特性。,?,采样：,有针对性地采集样品。,?,增殖：,人为地通过控制养分或培条件，使所需,菌种增殖培养后，在数量上占优势。,?,分离：,利用分离技术得到纯种。,?,发酵性能测定：,进行生产性能测定。这些特性,包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特,性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温,度、生长和发酵最适温度、最适,pH,值、提取工,艺等。,新菌种分离与筛选的步骤,（,一）采样,1,、采样对象,以采集土壤为主。一般园田土和,耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为,主，富含碳水化合物的土壤和沼

3、泽地中，,酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和,果园内。采样的对象也可以是植物，腐,败物品，某些水域等。,采样和采集方法,?,为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的,细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域,中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。,?,样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样,采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋,和塑料瓶等。,采样的注意事项,1,、采样时应尽可能保持相对无菌；,2,、所采集的样本必须具有某种代表性；,3,、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集,日期、地点以及采集地点的地理、生态参数,等；,4,、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为,真正的原地菌群的出

4、现可能是短暂的；,?,5,、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应,贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因,为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离,了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生,变化，微生物群体之间就会出现消长,1,土样采集方法,?,森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层,顺序采集；,?,水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆,筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面,5,15cm,处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻,璃瓶中。,?,在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢,慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约,20min,，洗,去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根,

5、部残留的土，这部分上却为根际土样。,2,植物体采集方法,?,在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔,器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切,取一小块，并注意不要损伤周围边缘。,?,选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在,一片叶上的取样部位。,?,采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法,相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，,一般与根际土样一起保存。,3,水样采集方法,?,用于细菌检测的水样应收集于,100m1,干净、灭菌的,广口塑料瓶中。,?,由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的,静水层中采集水样。,?,方法是：握住采样瓶底浸入水中,30-50cm,处，然后,瓶口朝下打开

6、瓶盖，让水样进入。如果有急流存,在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水,中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装,满采样瓶。所有水样都应在,24h,之内迅速进行检测，,或者,4,下贮存。,（二）增殖培养,?,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生,物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择,性培养基，选择一定的培养条件来控制。,?,例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤,维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生,长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下,阶段的纯种分离就会顺利得多。,（三）培养分离,?,尽管通过增殖培养效果显著，但还是,处于

7、微生物的混杂生长状态。因此还必,须分离，纯化。在这,步，增殖培养的,选择性控制条件还应进一步应用，因此，,建立一更为科学的和针对性强的分离方,法是必要的。,分离富集方法,?,运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中,添加若干抗生素、复杂底物及生长因子,的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，,可以建立起若干富集技术。,?,富集可以促进抗性的产生并维持下来。,?,土样中细菌的富集：适度稀释后，取,0.1m1,涂布已,添加及未添加富集底物,(,如几丁质、纤维素等,),的,土浸出汁平板。,?,植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液,适度培养取样，洗涤，取,1ml,经适度稀释后涂布平,板。,?,水中细菌的分

8、离：水样通过0.22m无菌滤膜，取,出滤膜用,1ml,无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用,样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压,印分离法。,次代培养及纯化步骤,1,、涂布的平板经培养后，菌落形成后可根,据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的,鉴定和区分。,2,通过高倍放大进行镜检，则按涂布不同,稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落,对琼脂平板进行分类。,次代培养及纯化步骤,2,、将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭,菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板,上进行影印培养。,3,、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学,特征如色素、菌落形态等进行最初分组。,4,、将认为有希望的菌落用

9、牙签转接到另一模拟,分离琼脂平板上进行筛选。,（四）筛,选,?,这一步是采用与生产相近的培养基和,培养条件，通过三角瓶的容量进行小型,发酵试验，以求得适合于工业生产用菌,种。,生产选种,?,是在长年累月的生产实践中，在培养工艺,条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批,次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变,异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应,于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种,优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行,类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种,的目的。,（五）毒性试验,?,自然界的一些微生物是在一定条件,下产毒的，将其作为生产菌种应当十分,当心，尤其

10、与食品工业有关的菌种，更,应慎重。据有的国家规定，微生物中除,啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉,和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，,其他微生物作为食用，均需通过两年以,上的毒性试验。,第二节,工业菌种的育种,?,是运用遗传学原理和技术对某个用,于特定生物技术目的的菌株进行的,多方位的改造。通过改造，可使现,存的优良性状强化，或去除不良性,质或增加新的性状。,菌株选育的目的,?,提高生产能力,?,提高产品质量,?,开发新产品,?,解决生产实际问题,?,防止菌种退化,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易错,PCR,、同序法,DN

11、A Shuffling,等,工业菌种育种的方法,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为,10,-8,10,-9,自然突变有两种情况,：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌,株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负,突变,。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，,这种突变成为正突变。,一、自然选育,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产,高产的重要措施。,回复突变,：高产菌株在传代的过程中，由于自然,突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种,情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为

12、菌种的分离纯化。,单细胞,(,孢子,),悬液的制备,平板分离,挑选单菌落,(,注意形态的观察,),发酵试验,诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变,进行的筛选，,是迄今为止国内外提高菌种产,量、性能的主要手段。,诱变剂：,能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理,化学,一、诱变剂和诱变处理,?,物理诱变剂：射线如紫外线、,X,射线、,射线，快中子；,?,物理因素中目前使用得最方便而且十分,有效的是紫外线。许多高产菌株的选育,都用过紫外线，对于一般实验室、中小,型工厂都适用，也很安全。,化学诱变剂：,化学因子如碱基类似物、,5,氟尿嘧啶、烷化,剂等。,化学诱变剂中使用最多、

13、最有效的是烷化剂。,化学诱变剂的优缺点,1,、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离,辐射更有效,2,、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的,合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，,一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，设备,费用大，并要注意安全性。,3,、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须,非常谨慎,.,二、诱变育种步骤,?,出发菌株的选择,?,处理菌悬液的制备,?,诱变处理,?,中间培养,?,分离和筛选,(,一,),出发菌株的选择,1,自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较,敏感，容易达到好的效果。,2,在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较,相像，也是良好的出发菌株。,3,每次诱变

14、处理都有一定提高的菌株，往往多,次诱变能积累较多的提高。,4,出发菌株开始时可以同时选,2,3,株，在处理,比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,5,要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细,胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部,分是隐性的，特别是高产基因。,6,根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱,变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会,使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂,是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的,作用于休止期，就可选用孢子。,(,二,),处理菌悬液的制备,?,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、,活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的,培养，

15、并要离心，洗涤，过滤。,(,三,),诱变处理,根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，,结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,(,四,),中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有,一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀,释过程,(,生理延迟,),，需,3,代以上的繁殖才能将,突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和,获得稳定菌株都是极为重要的。,方法：,让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小,时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几,代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异,就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，,直接在平皿上分离就会出现变异和

16、不变异细胞,同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，,以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,(,五,),分离和筛选,?,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求,的分离菌落为目的，以量为主。,?,复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在,具体方法上就有差异,.,例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料,或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复,筛者，而将,90%,的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较,参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以,后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,(6),消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的

17、结构类似,物抗性。,基因育种,?,基因重组育种：是运用体外,DNA,各种操作或修,改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质,粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细,胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表,达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞,的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给,另,个细胞的方法。,基因的直接进化,(directed,evolution),?,突变,基因突变库的建立,?,筛选,基因突变库的筛选,?,基因复制与遗传,步骤：,在分子水平上，对目标基因直接处理，,然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的,性能。,选择育种方法时综合考虑的因素,(1),待改良性状的本质及与发酵工艺的关系,(,如,批式或连续发酵试验,),；,(2),对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识,的明了程度；,(3),经济费用。,?,如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，,则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：,?,如果