DNS法测定总糖和还原糖

1、实验九 总糖和还原糖的测定（二） 3,5二硝基水杨酸法一、目的要求： 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。黄色 桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。（2）3,5二硝基水杨酸试剂

2、：称取6.3 g 3,5二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。（3）碘碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。（5）0.1% 酚酞指示剂。（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm180mm试管，按下表加入1.0m

3、g/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。试剂管号012345678葡萄糖标准液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4水杨酸溶液(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。=540nm处测定吸光度以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品中还原糖的提取准确称取 0.5g小麦（淀）粉，放在100ml

4、烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。3、样品总糖的水解及提取准确称取0.5g小麦(淀)粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。4、样品中含糖量的测定试剂空白还原糖总糖样品溶液(ml)01.01.0蒸馏水(ml)2.01.01.0水杨酸(ml)1.501.501.50将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。=540nm处测定吸光度样品溶液中还原糖和总糖测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。五、结果处理 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量： 式中：C还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；V还原糖或总糖提取液的总体积，ml； m样品重量，g；1000mg换算成g