Grx-1基因敲除鼠的繁殖及子代基因型鉴定

1、Grx-1基因敲除鼠的繁殖及子代基因型鉴定刘秋彤，韩文莉，郭春宝，邓 春作者简介 刘秋彤（1987-），女，重庆，硕士研究生，E-mail:通讯作者 邓春（1968-），女，主任医师，研究方向：新生儿慢性肺损伤分子机理，E-mail:(重庆医科大学附属儿童医院，重庆400014） 摘要 目的 探讨glutaredoxin-1(Grx-1)基因敲除小鼠的优化繁殖及子代鼠的鉴定方法，为进一步研究Grx-1在支气管肺发育有不良(BPD)中的作用奠定基础。方法 将从美国哈佛医学院引进的纯合子Grx-1基因敲除小鼠进行饲养繁殖，繁殖出的子代中

2、将出现纯合子、杂合子以及野生型3种基因型。从出生起观察其生长发育情况，2周龄时从子鼠尾部提取基因组DNA，用PCR方法扩增目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳结果判定基因型。结果 Grx-1纯合子小鼠的饲养繁殖取得成功，获得了一批Grx-1基因敲除纯合子小鼠。结论 正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得Grx-1基因敲除纯合子小鼠的有效途径，为相关研究提供动物实验模型奠定了基础。关键词 谷氧还蛋白；基因敲除；基因型鉴定；氧化应激中图分类号 R-332；Q95-33Breeding and identification of glutaredoxin-1 knockout miceLiu Qiutong, H

3、an Wenli, Guo Chunbao, Deng Chun (Childrens Hospital Affiliated to Chongqing Medical University,Chongqing 400014, China)Abstract Objective To explore the optimal way of breeding and identification of glutaredoxin-1（Grx-1） knockout mice and to establish an animal experimental model for further study

4、on the important role of Grx-1 gene. Methods Breeding homozygote genotype mice obtained from Harvard Medical School, reproductive success of their offspring will appear in three genotypes: wild-type, heterozygous and homozygous. To observe the offsprings growth and development, genomic DNA of each m

5、ouse was extracted from the tail of two-week-old mice. PCR method was employed to amplify the Grx-1 gene fragment, and the gene type was observed by electrophoresis. Results Breeding and reproducing were successful and gained number of homozygous knockout mice. Conclusion Appropriate methods of bree

6、ding and identification is an effective way to obtained homozygous Grx-1 knockout mice wich could provide as an experimental model of relevant research.Key words Glutaredoxin; gene knockout; gene identification; oxidative stress. Corresponding author: Deng chun,Tel: (023)63621839, E-mail:dengcgcbyah

7、 谷氧还蛋白(Grx)是体内重要的氧化还原物质之一，在细胞内氧化还原平衡的调控以及抵抗氧化应激损伤过程中发挥着重要作用1。人类有两种谷氧还蛋白同工酶(Grx-l和Grx-2)2，Grx-l定位于胞液中，Grx-2分布在线粒体和核膜上。Grx-l的抗氧化作用明显强于Grx-23，因此对Grx-1氧化还原的研究有助于明确氧化应激相关疾病的致病机理。近来也有文献报道Grx-2在脊椎动物大脑的发育方面至关重要4，总之Grx家族是人类生理和病理过程中至关重要的氧化还原物质，但其在各种疾病中的具体机制仍不明确。研究发现导致支气管肺发育不良(BPD)的高氧环境对发育肺Grx-1/S-谷胱甘

8、肽化(PSSG)氧化还原模块功能产生影响，从而进一步调控NF-kB信号通路5。为进一步探讨Grx-1是如何参与高氧所致BPD的发病机制，本课题组从哈佛医学院波士顿儿童医院引进两只纯合子Grx-1基因敲除小鼠，将其饲养繁殖于符合国家标准的SPF屏障环境中。获取一批Grx-1基因敲除小鼠模型，为深入研究Grx-1在BPD中Grx-1/PSSG作用方式、功能及与BPD发生的相互关系开辟新的研究途径。1 材料与方法1.1 主要试剂 REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit购自Sigma公司；PCR引物由提供上海英骏生物技术有限公司合成；琼脂糖购自重庆鼎国生物技术有限责任公司；R

9、nase-free ddH2O和DNA Marker购自天根试剂公司，其它试剂为国产分析纯。1.2 实验动物 纯合子Grx-1基因敲除小鼠由美国哈佛医学院波士顿儿童医院病理学副教授Hongbo R. Luo惠赠，2只雌性，品系为C57BL/6J；基因背景为Grx-1基因敲除纯合子(Grx-1 -/-)。1.3 小鼠的饲养和繁殖小鼠的饲养按照SPF动物饲养标准执行，经隔离饲养观察未见异常后进入饲养区，严格按照SPF动物管理相关规定进行实验操作。饲养屏障环境内温度控制在2025 ，湿度控制在50%60，饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理后使用；实行自由采食和饮水，垫料每周更换两次。将Grx-1

10、 -/-雌性和C57BL/6J野生型(WT)雄性小鼠按l:l配对，出生小鼠子一代喂养母乳至3周后断离母乳。母系停止哺乳2周后按上述方法配对，子一代8周龄时与同代之间按雌雄比例1:1配对。1.4 小鼠的基因型鉴定1.4.1 小鼠尾部组织DNA基因组的提取 在子鼠2周大时，将小鼠尾部组织剪取长约0.51.0 cm的小段于1.5 ml Eppendolf管中，按照REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kit使用说明书操作，先分别加入100 l Extraction Solution和25 l Tissue Preparation混匀，室温放置10分钟，然后95金属浴3分钟，再加

11、入100 l Neutralization Solution B涡旋混匀，取适量上清液用于扩增目的基因片段。1.4.2 小鼠基因型的聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳 设计引物序列如下：Grx5: 5- CCA GCT CTC AGG AGA TGA CC-3；Grx6: 5- AAA ATC CCA CAC CCC TTT TC-3，目的基因片段长度699 bp，是敲除区域基因片段；Neo1: 5- GCT TGG GTG GAG AGG CTA TT - 3；Neo2: 5- GAA CTC GTC AAG AAG GCG ATA- 3，目的基因片段长度750 bp，是替换的基因片段

12、。PCR体系：1）Grx-1基因：H2O 5 ul ，Mix 10 ul，Primer Grx5 (10 umol/l) 2 ul， Primer Grx6 (10 umol/l) 2 ul， DNA 1 ul，共20 ul。2）Neo基因：H2O 5 ul ，Mix 10 ul，Primer Neo1 (10 umol/l) 2 ul，Primer Neo2 (10 umol/l) 2 ul，DNA 1 ul，共20 ul。PCR扩增条件：预变性：95 ，5 min；变性：95 ，30 s；退火：65 ，30 s；延伸：72 ，1 min，共35个循环；最后延伸：72 ，5 min；4 保存

13、。2琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖0.3 g，1TAE 15 ml；上样：DNA 5 ul。电泳电压100 V，时间30 min。小鼠基因型鉴定结果的判定方法：Grx-1 -/-不含Grx-1位点，只含有Neo位点，即仅有750 bp条带；Grx-1 +/-含有Grx-1位点和Neo位点，则有699 bp和750 bp两条带；WT不含Neo位点，只含Grx-1位点，则仅有699 bp条带。2 结果2.1 Grx-1基因敲除小鼠的繁殖情况 引进的2只雌性Grx-1基因敲除纯合子小鼠与C57BL/6J的野生型雄鼠1:1交配，并成功繁殖出子一代幼鼠。按1.4项对小鼠基因型进行鉴定，其结果是：母系2次繁殖得到

14、的31只子一代幼鼠中，均为Grx-1基因敲除杂合子小鼠，其中雌性16只，雄性15只。子一代8周龄时按1:1相互交配，得到125只子二代幼鼠，按照同样方法进行鉴定，其中32只是Grx-1基因敲除纯合子小鼠，59只是Grx-1基因敲除杂合子小鼠，34只是野生型小鼠，分别占25.6% 、47.2% 和27.2%，子代基因型基本符合孟德尔遗传规律。2.2 Grx-1基因敲除小鼠的大体形态观察 Grx-1基因敲除纯合子小鼠生长良好，反应正常。其出生后第1、3、7、14、21天与同日龄野生型小鼠体重相比较，结果无统计学差异。Grx-1基因敲除纯合子母鼠与子代幼鼠生长情况详见图1、图2。图1 Grx-1纯合

15、子母鼠成功繁殖出1天龄子一代幼鼠图2 Grx-1纯合子母鼠及2周龄幼鼠2.3 子代基因型鉴定 子代利用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型，图3中1号仅出现750 bp，为Grx-1基因敲除纯合子；2-7号出现699 bp和750 bp条带，为Grx-1基因敲除杂合子；8号只出现699 bp条带，为野生型小鼠。1：Grx-1 -/-；2-7：Grx-1 +/-；8：WT图3 Grx-1基因敲除鼠子二代鉴定结果3 讨论 Grx-1作为细胞内一种重要的抗氧化剂和氧化还原信号传导途径中的重要调控因子6，通过催化谷胱甘肽（GSH）与蛋白质二硫键之间进行氧化还原反应，从而修复蛋白质的活性7。GSH可影响多

16、种蛋白的活性，因此可逆性的谷胱甘肽在特定蛋白上的调节可改变细胞的动态平衡从而影响机体的健康或者疾病状态8。除此之外，Grx-1目前还被认为是细胞内一种重要的抗凋亡因子，可间接影响细胞信号转导途径中的重要激酶的谷胱甘肽化，在调节细胞生长和细胞凋亡的多条信号通路中发挥作用9-10。已有大量研究表明Grx-1与人类多种疾病密切相关，如：糖尿病11、心血管疾病12、哮喘13、白内障14等。在肺组织中Grx-1的表达具高度的细胞特异性并呈现高表达状态，而在肺炎纤维化区域Grx-1表达呈阴性，提示了纤维化肺病与Grx系统损害有密切关系15，而肺纤维化是高氧环境导致BPD的主要病理变化之一。有研究发现，高氧

17、环境对发育肺Grx-1/PSSG氧化还原模块功能产生影响5。为开辟深入研究Grx-1在BPD中Grx-1/PSSG作用方式、功能及与BPD发生的相互关系，我们成功引进了Grx-1基因敲除小鼠，并按照SPF级动物饲养标准进行饲养和繁殖，采用PCR和琼脂糖凝胶电泳对其子代可能出现3种表型：Grx-1 -/-、Grx-1 +/-和WT进行基因型鉴定，繁殖结果基本符合孟德尔遗传定律。在繁殖过程中发现，Grx-1基因敲除杂合子小鼠雌雄1:1配对是得到Grx-1纯合子小鼠的有效途径，Grx-1基因敲除纯合子小鼠生长、繁殖状态以及出生死亡率并没有明显升高，一定数量Grx-1纯合子为我们后续实验提供了有利的条

18、件。Grx-1基因敲除小鼠在研究Grx-1相关疾病方面较其他任何研究方法都更加直观有效，有助于探讨Grx-1在BPD、氧化应激反应中的作用以及谷胱甘肽化蛋白质在各种相关疾病中的作用机制，这对于预防和治疗人类氧化应激相关疾病有重要的意义。参考文献 1.Chung S, Sundar I K, Yao H, et al. Glutaredoxin 1 regulates cigarette smoke-mediated lung inflammation through differential modulation of IB kinases in mice: impact on histone

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