食品学院-肠溶多肽水凝胶对保加利亚乳杆菌的控释作用研究

1、中南林业科技大学大学生研究性学习和创新性实验计划项 目 结 题 报 告项目名称肠溶多肽水凝胶对保加利亚乳杆菌的控释作用研究及相关产品开发项目主持人刘馥歌所在学校及院系中南林业科技大学食品科学与工程学院项目级别国家级 省级 校级立项年份2014年9月指导老师张琳联系电表日期2016年11月中南林业科技大学教务处制填写说明一、本表要按要求逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。空缺项要填“无”。二、格式要求：表格中的字体用小四号仿宋体，1.5倍行距；需签字部分由相关人员以黑色钢笔或水笔签名。均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。三、本页不装订。一、基本情况项目名称

2、肠溶多肽水凝胶对保加利亚乳杆菌的控释作用研究及相关产品开发立项时间2014年9月完成时间2017年4月项目主要研究人员序号姓 名学号专业班级所在院（系）项目中的分 工1刘馥歌20133936粮食工程1班食品科学与工程学院负责人2郭胜雄20133932粮食工程1班食品科学与工程学院水凝胶制备操作探究3李艳20133934粮食工程1班食品科学与工程学院水凝胶性质检测及数据记录4周晓华20133959粮食工程1班食品科学与工程学院菌的活化培养检测及资料整理分析5二、研究成果简介项目成果类型产品 系统软件 论文 专利 其它（注：请在相应成果复选框内打“”，其它请具体说明）项目成果名称珍珠奶项目研究的目

3、的、意义；研究成果的主要内容、重要观点或对策建议；研究成果和研究方法的特色；实践意义和社会影响。限定在2000字以内。（一）主要目的：本实验旨在研究具有包埋和保护特性的肠溶性多肽杂化水凝胶，利用肠溶性多肽杂化水凝胶为载体对肠道益生菌保加利亚乳杆菌进行包埋。在胃液中，包有肠道益生菌的凝胶能够保护益生菌不受强酸破坏，并能稳定存在，以减少直接食用肠道益生菌而导致的失活问题；在肠道中，包有肠道益生菌的凝胶从弱碱性环境中释放出益生菌，以达到益生的作用。（二）项目意义：目前，市场上销售的益生菌饮料大都直接将益生菌添加在饮料中，通过直接饮用，饮料中的益生菌（特别是肠道益生菌）在胃液中已经失活，无法被人体有效

4、利用。针对该问题，本项拟利用肠溶性多肽杂化水凝胶包裹保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌，在酸性条件下（胃液环境中）凝胶包裹保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌，以保护其活性；在弱碱性条件下（肠道环境中）凝胶的三级网络结构坍塌，使保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌释放出来，从而实现其在肠道中的功能，达到被人体更好利用的效果。本课题的研究将为益生菌提供一种可以在肠道中控制释放的新型包埋材料，为解决益生菌在胃酸条件下失活的问题提供有效的方法。（三）研究成果的主要内容1研制出酸性条件下分解的多肽水凝胶一种，利用其包埋大蒜精油，研究了包埋率及其对大蒜精油的控制释放作用。2 完成了具有肠溶特性的多肽杂化水凝

5、胶的配方及其特性研究。3 利用肠溶性多肽杂化水凝胶包埋保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌，并检测了包埋率。4 模拟胃肠道环境，将凝胶包埋后的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌以及未经包埋的样品分别放到模拟胃肠道环境下，研究了包埋和未包埋的混合菌在胃中存活率和肠道中的释放性，从而研究了肠溶性多肽杂化水凝胶对混合菌的控制释放作用。5将包埋了保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌的凝胶加入到乳酸饮料中制成初步产品。（四）重要观点及建议：1本项目利用多肽作为水凝胶因子，通过改变多肽的序列和配方，成功研制出中性条件下包埋，酸性条件下释放的多肽水凝胶 (Fmoc-F)，并用其包埋大蒜精油，可以控制大蒜精油在大

6、肠杆菌的对数生长期时释放并起到抑菌效果。通过包埋，多肽水凝胶成功掩盖了大蒜精油的不良气味。2 本项目也成功研究出了酸性条件下成胶，肠道条件下溶解的多肽杂化水凝胶，利用其包埋保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌，成功起到了在胃酸条件下保护混合菌，在肠道中释放的作用。总之，通过本项目的研究，我们成功研制出了pH响应的多肽水凝胶，不同的水凝胶对大蒜精油和保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌具有良好的控制释放作用。因此，对于易挥发的有效成分或者容易被胃酸破坏的有效成分，我们可以通过生物相容性好的多肽水凝胶进行包埋，起到保护作用，为食品工业中包埋材料的发展提供有效的途径。（五）研究成果和研究方法的特色研究成果：

7、1. 通过本项目的研究，我们于2016年7月在中文核心期刊粮食与油脂杂志上发表论文“自组装多肽水凝胶包埋大蒜精油的控释研究”一篇；2. 制出肠溶性多肽杂化水凝胶，并将其添加入乳制品中，制成产品。相关论文还在撰写中。研究方法的特色：本项目较早将多肽水凝胶应用到食品活性成分的控制释放领域，对食品活性成分的包埋材料的研究具有重要意义。（六）实践意义和社会影响：通过本项目的研究，我们研制出了具有pH响应的多肽水凝胶：一种在酸性条件下分解的水凝胶，可应用于大蒜精油的包埋，通过包埋可以控制大蒜精油在大肠杆菌的对数生长期释放起到抑菌效果；一种肠溶性多肽杂化水凝胶，可以包埋肠道益生菌，在胃酸条件下保护益生菌不

8、失活，在肠道环境中凝胶分解并释放出益生菌，使其发挥生物活性。本项目的研究为食品活性成分的包埋材料提供了一个新的方向，具有较强的实用价值，后期进入市场会具有一定的社会影响。三、项目研究总结报告项目研究和实践情况，研究工作中取得的主要成绩和收获，研究工作有哪些不足，有哪些问题尚需深入研究，研究工作中的困难、问题和建议。（字数不限，可加页面）（一）项目研究和实践情况1研制出酸性条件下分解的多肽水凝胶一种，利用其包埋大蒜精油，研究了包埋率及其对大蒜精油的控制释放作用。2 完成了具有肠溶特性的多肽杂化水凝胶的配方及其特性研究。3 利用肠溶性多肽杂化水凝胶包埋保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌，并检测了包

9、埋率。4 模拟胃肠道环境，将凝胶包埋后的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌以及未经包埋的样品分别放到模拟胃肠道环境下，研究了包埋和未包埋的混合菌在胃中存活率和肠道中的释放性，从而研究了肠溶性多肽杂化水凝胶对混合菌的控制释放作用。5将包埋了保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌的凝胶加入到乳酸饮料中制成产品。（二）实验结果如下：1 Fmoc-F自组装多肽水凝胶包埋大蒜精油实验1.1 Fmoc F自组装多肽水凝胶的形成如图1所示，将Fmoc F 溶解在NaOH溶液后，溶液中的Fmoc F分子呈现无规则状态（图1A）。加入GDL后，GDL水解生成的H +使溶液pH逐渐下降至Fmoc F的等电点附近。此时

10、，分子间的非共价键力（疏水作用力、氢键、 堆积等）使Fmoc F分子逐步聚集，组装成规则有序的一维纳米结构（图1B），随着组装的进一步深入，一维纳米结构相互缠结成三维的多孔状网络，从而束缚住水分子形成了透明的、自支撑的半固体凝胶（图1C）8。在该水凝胶体系中，Fmoc F的浓度仅为1 % ( w / v)，即一分子Fmoc F可以束缚2152个水分子，说明Fmoc F具有非常强的截留能力。图1 Fmoc F凝胶制备示意图1.2 Fmoc F自组装多肽水凝胶及 环糊精对大蒜精油的包埋率图2 大蒜精油含量标准曲线 以大蒜精油浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标做大蒜精油含量标准曲线，如图2。由图2可知，

11、浓度在1.80 mg / L 10.80 mg / L时，大蒜精油在210 nm下的吸光值与大蒜精油浓度呈良好的线性关系，标准曲线方程为Y = 0.0146 + 0.0761 X（R 2 = 0.996）。 分别利用Fmoc F自组装多肽水凝胶和 环糊精对大蒜精油进行包埋，利用大蒜精油含量标准曲线计算包埋率，比较包埋物的芯材壁材比，结果如表2表1 Fmoc F自组装多肽水凝胶及 环糊精包埋产物性质包埋材料包埋率芯 / 壁材比（mL：g）Fmoc F自组装多肽水凝胶97.07 %1 : 0.42 环糊精6.60 %1 : 8从表1可知，Fmoc F自组装多肽水凝胶对大蒜精油的包埋率（97.07

12、%）显著大于 环糊精（60.60%），而且包埋1 mL芯材，所需要的Fmoc F质量（0.42 g）仅为 环精（8 g）的5.25%。因此，Fmoc F自组装多肽水凝胶是一种高效的大蒜精油包埋材料。1.3 Fmoc F自组装多肽水凝胶的pH响应特性为了研究Fmoc F自组装多肽水凝胶在不同pH条件下的分解情况，分别将Fmoc F凝胶置于不同pH的缓冲溶液中检测其分解率，如图3。图3 不同pH条件下Fmoc F自组装多肽水凝胶的分解率Fmoc F成胶后，测得其pH为7.2。在pH = 6.5的缓冲液中，凝胶仅在最初的5 min内分解了11.1 %（图3，pH 6.5），在随后的5 150 min

13、内几乎没有分解（150 min，分解率12.17 %）。在pH = 6.0和pH = 5.5的缓冲液中，凝胶的分解率逐渐增长，到90 min时其分解率分别为35.44 %和51.48 %（图3，pH 6.0和pH 5.5），90 150 min内分解率（150 min，34.70 %和51.56 %）没有显著变化。在pH = 5.0的缓冲液中，前90 min FmocF的分解率不断增加，90 min时有91.45 %的Fmoc F凝胶分解（图3，pH 5.0），在150 min时凝胶彻底分解（分解率100 %）。以上结果表明，Fmoc F凝胶对pH有显著响应。在pH = 7.2时，分子之间的非

14、共价键力作用使得凝胶形成；在pH 6.5时，凝胶几乎不分解，其三级网络结构稳定且完整；当pH 19（表1，当n = 30， = 0.001时，所需最少正确答案数为19)，所以 0.001，A、B两个样品存在极显著差别。给出正确答案的评价人员均表示，B样品有强烈的刺激性大蒜气味，而A样品几乎不存在不良气味，这说明Fmoc F凝胶几乎可以完全掩盖大蒜精油的不良气味。2 混合菌的活化与培养和肠溶性水凝胶的探索结果由于保加利亚不易培养，因此我们保加利亚乳杆菌换成保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌有利于保加利亚乳杆菌的培养。2.1 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌总数表5保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合

15、菌总数平板bccef稀释倍数10100100010000100000菌落数/（cfu，ml）不可计数不可计数不可计数20420菌落总数/（cfu，ml）2.0*108我们称取0.5g直投式混合菌粉溶于5ml生理盐水中 制作原始菌液，以e组平板为样品，进行平板计数，经计算得到菌总数2.0*108cfu/ ml。2.2肠溶性多肽成胶过程中pH值的变化测定分别在加GDL之前，刚加入GDL，以及加入GDL至完全成胶三个时间段进行pH测定，如表6所示：表6肠溶性水凝胶pH的测定环境条件A（加GDL前）B（刚加GDL）C（成胶后）水凝胶pH值测定9.556.164.15从表中可看出加入GDL后，GDL水解

16、生成的H +使溶液pH逐渐下降。此时，分子间的非共价键力（疏水作用力、氢键、-堆积等）使FmocY分子逐步聚集，组装成规则有序的一维纳米结构，随着组装的进一步深入，一维纳米结构相互缠结成三维的多孔状网络，从而束缚住水分子形成了透明的、自支撑的半固体凝胶。3肠溶性多肽水凝胶的包埋与检测3.1肠溶性水凝胶在模拟胃、肠道中释放情况的研究图4杂化胶m（Fmoc-F）：m（明胶）为1/14时在不同pH下随时间的分解情况图 图4为杂化胶包埋直接放置在不同PH下随时间变化，吸光度的变化值，从图4中，可以看出PH为7.5和9.0的杂化胶分解能力强，在PH为1.7条件下杂化胶的分解性能差。因此我们得出：该杂化胶

17、具有很好的pH响应，可用作包埋混合菌的载体。3.2杂化胶包埋活菌的存活率包埋率随明胶浓度变化图 通过用不同配比的杂化胶对对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌进行包埋，并测定其保留率，得到杂化胶的最佳配比。图5(a) 在m（Fmoc-F）：m（明胶）比例为1/14的杂化胶 包埋率随明胶浓度的变化图5(b) 在明胶浓度为25%条件下杂化胶内不同比例对混合菌的包埋率由图5（a）可知，在杂化胶比例一定时混合菌的包埋率随着明胶浓度的升高而增大，与Fmoc-Y的含量无显著关系。由图5 ( b )可知，在两种胶比例为1/14时随着pH增大，溶解度增大，当明胶浓度大于55%后，无法成胶。因此，出于释放时间的考虑

18、，我们选择了明胶浓度为55%，m(Fmoc-Y)/m(明胶)=1/14这一配比。3.3 保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的包埋与检测本实验采用直投式菌粉作为原料，直接取菌粉在复活后包入水凝胶中，待成型后先放入胃液模拟液中并在震荡器中放置2小时，随后向其中加入肠道模拟液并放置1小时继续取部分均与混合液并测定菌活性。表7：水凝胶对保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的包埋率载体水凝胶包埋率/%97.452.31 参考文献利用大豆皮果胶凝胶包埋保加利亚乳杆菌的初步研究 中，果胶在不同PH下对保加利亚乳杆菌的包埋率70.132.65，由表6可知肠溶性水凝胶对混合菌的包埋效果比果胶的包埋效果好。表8：在模拟胃肠道环境下

19、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌的存活率样品水凝胶不包埋存活率/%85.502.034.432.13由表8得出在模拟的胃肠道环境中水凝胶包埋的混合菌存活率为85.502.03远高于不包埋的混合菌，表明保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌经肠溶性杂化水凝胶包埋后其耐酸性显著提高。3.4成功将包埋有混合菌的水凝胶投放到饮料中。 图6（a） 图6（b）图6表示的是包埋保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌的肠溶性杂化水凝胶在稀释过的乳酸饮料中的静置状态（原饮料呈乳白色无法看到水凝胶的存在），从图中可知肠溶性水凝胶在饮料中性质较为稳定。（三）研究工作中取得的主要成绩和收获通过本项目的研究，我们研制出了具有pH相应的多肽水凝胶:一种酸性条件下分解的水凝胶可应用于大蒜精油的包埋，通过包埋可以控制大蒜精油在大肠杆菌的对数生长期释放起到抑菌效果；一种肠溶性多肽水凝胶可以包埋乳酸菌，在胃酸条件下保护乳酸菌不失活，在肠道环境中分解释放乳酸菌，使其发挥生物活性。在本次实验探究中，我们对水凝胶的性能，作用，理化性质有了更深的理解，在研究实验的方法上我们掌握了更好的方法让实验更加有效，此外，在这个过程中我们四个人分工明确，有问题及时解决，配合度大大提高，在遇到失败时，一