微生物室SOP文件

1、内江市第六人民医院作业指导书 内内江江市市第第六六人人民民医医院院检检验验科科 微生物室微生物室微生物室微生物室微生物室微生物室 sopsopsopsopsopsop 文件汇编文件汇编文件汇编文件汇编文件汇编文件汇编 （第四版）（第四版） 编制：编制： 郭梓郭梓 审核：审核： 李泰均李泰均 批准：批准： 吴燕云吴燕云 生效日期：二零一二年一月一日生效日期：二零一二年一月一日 内江市第六人民医院检验科微生物室 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 1 - 1. 细菌室人员岗位职责.2 2. 细菌室工作人员管理规定及报告时间.4 3. 标本采集及保存要求7 4. 显微镜检查法操作规程9

2、 5. 细菌室标本操作流程11 6. 细菌室形态检查操作规程13 7. 细菌生化反应鉴定及其他实验操作规程18 8. 细菌的接种与培养方法操作规程23 9. 支原体培养、鉴定、计数及药敏操作规程25 10. 血液感染病原体检验操作规程27 11. 中枢神经系统感染病原体检验操作规程29 12. 创伤和外科感染病原体检验操作规程31 13. 下呼吸道感染病原体检验操作规程32 14. 消化道感染病原体检验操作规程34 15. 尿路感染病原体检验操作规程35 16. 脓汁及病灶分泌物细菌检验操作规程36 17. 生殖系统标本的处理38 18. 超广谱 内酰胺酶（ESBLsESBLs）检.40 19

3、. 消毒灭菌效果监测.41 20. 环境卫生学监测.42 21. 采样及检查原则 .43 22. 各部位的消毒.48 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 2 - 文件 编码 JYK-SOP001 文件 名称 细菌室人员岗位职责 执行时间 （第四版） 2012.02.01 细菌室人员岗位职责 1、上班后先搞好室内卫生、核查各个培养箱、冰箱的工作温度是否在设定的范围内，并 做好记录。 2、检查各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作。 3、接收样本：核对各样本号与申请单联号是否一致，如不一致马上与病房联系以便作出 相应的处理，如退单或重送样本等，并做好联系情况的

4、记录。核查各送检样本是否符合要求。 痰液样本：先看外观、再直接涂片镜检，低倍镜下见白细胞25 个，10上皮细胞25 个，上皮细胞 10 每个视野，为合格痰液。 无菌体液样本：检查各种无菌体液样本的盛放器皿是否符合要求。 容易干燥的样本：对一些容易干燥的样本如大便、咽拭子、脓液拭子、泌尿生殖道 拭子等是否已经干燥。 对不符合要求的样本必需与临床联系，以便作出相应处理，方法如联号不符的样本。做 好记录。对符合的样本进行原始单的登记。 7、样本编号：对符合的样本作出编号，普通细菌培养：痰液、咽拭子、血液增菌培养、 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 5 - 尿液、胸、腹水、脑脊液、胆汁

5、、脓液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培养。在各种培养基 上及申请单上编号的同时均需明确标明接种日期。 样本接种： 血液、骨髓、腹水、关节液等：血平板、Mac 痰液、咽拭子、脑脊液分别接种：血平板、巧克力平板、麦康凯平板； 尿液接种：血平板、巧克力平板、Mac； 各种无菌体液、脓液、泌尿生殖道分泌物接种：血平板；巧克力平板； 大便致病菌：接种 SS 平板、麦康凯平板； 分泌物的淋球菌培养接种：巧克力平板； 支原体培养+药敏，按说明书接种支原体专用培养瓶； 对以上接种样本的当前编号应记录于登记本上。此外对痰液在接种的同时应对其沉渣进 行革兰染色，如有细菌和或何种细菌为主即刻的向临床发出第一级初级报告

6、，并做好记录。 8、对一些不适合用仪器检测药敏的细菌，改用标准的 K.B 法进行检测。碰到异常的耐 药模式应及时上报组长，如碰到耐万古霉素的葡萄球菌、粪肠球菌，耐泰能的大肠埃希菌、 克雷伯菌属、肠杆菌属等。并加做特殊的药敏纸片，并改用纸片法加以比较。 9、对一些特殊细菌，如嗜血杆菌、棒状杆菌、李斯特菌属等用相应的鉴定条进行鉴定， 用相应的手工实验进行耐药性检测，操作严格参照说明书。 10、对所完成的各种发向临床的微生物学报告单，要认真检查，并给上行政班的人员核 查，确认一切无错后，方能发出。 11、做好菌种的保存，对一些难得的菌株、标准菌株等要定期移种，一般二周一次，并 做好移种记录。定期做好

7、本室所用各种鉴定药敏试条的质控，一周一次(或每个批号一次)， 做好记录。 12、检查本岗位各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作。 对需购买的试剂、平板、培养基、染色液以及需配置的培养基应及时交班。 13、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。离开科室前交好班。 二、行政上班人员二、行政上班人员 1、上班后首先搞好室内卫生。 2、将临床室的培养标本拿回。 3、对有新到岗的实习或进修人员时，应认真交代本岗位的一切事宜并且认真作好带教 工作。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 6 - 4、涂片染色：抗酸染色严格按照操作规程，漂浮法涂片痰液样本，胸腹

8、水、尿液、脑 脊液等取沉淀涂厚片，自然干燥后固定，按说明书染色后镜检。 5、临床标本细菌或门诊标本 G-双球菌涂片，应用滚动式涂片法从波片一端涂向另一端， 反复几次，火焰固定后进行革兰染色。 6、每天必须消毒平板、基础培养基等用于常规医院感染监测或 K.B 药敏试验；另外根 据具体情况即时准备好各种中和剂、无菌瓶等，对 48 小时的空气培养出报告，同时注意是否 有致病菌、菌落数是否超标。 7、检查本岗位各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作。 对需购买的试剂、平板、培养基、染色液以及需配置的培养基应及时交班。 8、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。 内江市

9、第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 7 - 文件 编码 JYK-SOP003 文件 名称 标本采集及保存要求 执行时间 （第四版） 2012.01.01 标本采集及保存要求 1、总则：用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本 应妥善保存。 2、临床标本的采集 2.1、下呼吸道分泌物(痰液) 令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌 塑料痰盒中，及时送检。 2.2、尿液(中段尿) 护理人员协助采取中段尿约 3ml 入无菌塑料盒中，及时送检。 2.3、粪便：取有粘液、脓血部分的粪便置无菌塑料盒中及时送检。 2.4、眼、耳、鼻、喉

10、拭子：将棉拭子沾取少许无菌生理盐水(如沾取的太多，可在无菌 生理盐水瓶壁上挤去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌塑料盒中，及时 送检。 2.5、脓液：用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌 塑料盒中，及时送检。 2.6、血液： 2.6.1、凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如 已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前 采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也可。 2.6.2、成人每次采血 510m1，小儿采血 23ml； 2.6.3、严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定

11、量血液后，无菌注入血培养瓶内， 轻轻摇匀， 2.6.4、从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。 2.7、穿刺液：胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液，严格无菌抽取后，注入含肝素抗 凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管 10 余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌 注入血培养瓶内及时送检。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 8 - 2.8、胆汁：由专科医生以无菌方法取引流液 10m1 注入无菌塑料盒内。 2.9、脑脊液：以无菌方法取脑脊液 35ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培 养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。 2.10、生殖器官标本：阴道、子

12、宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌塑料 盒内送检。 如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。 2.11、烧伤标本：以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌塑料盒中。 2.12、支原体(解脲、人型)培养+药敏的标本采集 2.12.1、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。 2.12.2、男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内 22.5 3、临床标本的保存 3.1、细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 9 - 文件 编码 JYK-SOP0

13、04 文件 名称 显微镜检查法操作规程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 显微镜检查法操作规程 显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴 定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌 尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 1、不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。 1.1、压滴法：用接种环取细菌悬液 2 环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜 下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。 1.2、悬滴法：取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各

14、1 块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士 林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅 速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压 碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的 改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。 2、染色标本检查法；通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染 色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。 2.1、快速革兰染色法 2.1.1、操作见试剂说明书 2.1.2、结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈

15、红色。 2.1.3、注意事项：染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜 过度，菌龄为 1824 小时为佳。 2.2、抗酸染色法 2.2.1、操作见试剂说明书 2.2.2、结果：抗酸杆菌呈红色。 2.2.3、注意事项：每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标 本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 10 - 2.3、阿尔培异染颗粒染色法： 2.3.1、初染：涂片上滴加第一液染剂(甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液)，染 35 分钟，水 洗。 2.3.2、复染：第二液染剂(碘化

16、钾溶液)染 1 分钟，水洗。自然干燥后镜检。 2.3.3、结果：菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。 2.3.4、注意事项：玻片要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。注意与标本中的其他杂质 相区别。 3、压片镜检，主要观察细菌在组织中的分布。 4、墨汁负染镜检：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜 等。 5、鞭毛染色镜检，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的鉴定 中是一项重要的指标。 6、暗视野镜检：观察一些较微小且有一定结构的微生物，如钩端螺旋体的钩状及螺旋 的形态等。 7、制动试验的直接镜检，在标本加入抗血清，观察动力是否被抑制，如霍乱弧菌的制 动试验等。 8

17、、荧光镜检，用标有荧光素的物质与检材中的微生物特异结合产生荧光的特点而对微 生物作出鉴定。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 11 - 文件 编码 JYK-SOP005 文件 名称 细菌室标本操作流程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 细菌室标本操作流程 1、标本的接受 1.1、标本接受的时间：原则上全天任何时间均可。 1.2、标本的接受：接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求是否相符以及 标本的质量等。 1.3、把接受的标本编号。 2、临床标本的接种 2.1、检验目的为细菌培养+药敏试验的各临床标本的培养基选择 2.1.1 标本类型 培养基 血 血培养瓶

18、中段尿 血平板、麦康凯平板、巧克力平板 脑脊液 血培养瓶、血平板、巧克力平板 穿刺液 血培养瓶、血平板、麦康凯平板、巧克力平板 胆汁 血平板、巧克力平板、麦康凯平板 呼吸道标本 血平板、麦康凯平板、巧克力平板 粪便标本 SS 平板、MAC 平板和血平板 病灶分泌物 血平板、巧克力平板、麦康凯平板 2.1.2、生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作：淋球菌培养接 种淋球 菌平板；念珠菌培养接种沙保罗培养基：支原体培养则按支原体培养的操作规程 操作；作普通细菌培养，则接种血平板和巧克力平板；衣原体抗原检测的按衣原体抗原检 测的操作规程进行检验。 2.2、接种的方法：中段尿标本无菌

19、取 10ul，在血平板的中间做垂直划线，然后分离划线。 其他际本做分区划线。 2.3、检验目的为找抗酸杆菌的按找抗酸杆菌的操作规程进行检验。 3、所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培养。 4、标本的培养条件、温度、时间 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 12 - 平板 培养条件、温度、C02 浓度、时间 血平板 孵箱、3537、1824 小时 巧克力平板 孵箱、3537、1824 小时 淋球菌平板 孵箱、3537、1824 小时 沙保罗平板 孵箱、2831、2436 小时 其他的平板 孵箱、3537、1824 小时 5、根据生长在平板上的细菌菌落形态、

20、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态 和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。 6、结果的报告 6.1、确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印。 7、对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求进行无害化处理。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 13 - 文件 编码 JYK-SOP006 文件 名称 细菌的形态检查操作规程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 细菌的形态检查操作规程 一、不染色标本的检查 压滴法和悬滴法。主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。将特制好的标本 置于显微镜载物台中央，先以

21、低倍镜观察，再用高倍镜观察。 结果：有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动(有明显的方向性)：无鞭毛的细菌呈布朗运动 (只在原地颤动而无位置的改变)。 二、细菌染色标本的检查 染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接 在玻片上涂布。菌落涂片时，先取生理盐水 l 滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中 涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌 鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高， 以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。 2.1、革兰染色 本染色

22、是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性 (紫色)和革兰阴性(红色)两类。 2.1.1、试剂 (1) 结晶紫溶液 A 液： 结晶紫 29 95乙醇 20ml B 液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前 24h 将 A 液、B 液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。 (2) 碘液 碘 lg 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 14 - 碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏 水至完全溶解。最后补足水量。 也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至

23、300ml。 (3) 脱色液：95乙醇。 (4) 复染液 A 贮存液：沙黄 2.5g 95%乙醇 100ml B 应用液： A 液 10ml 蒸馏水 90ml 染色方法： (1)涂片经火焰固定，加结晶紫液染 1 min，清水冲去染液。 (2)加碘液染 I min，水洗。 (3)加脱色液，不时摇动约 1030s，至无紫色脱落为止，水洗。 (4)加复染液，染30s，水洗。 (5)干后镜检。 2.2、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片 时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。 奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视

24、野中有些菌 细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。 抗酸染色有两种常用方法：口碱性复红法又称萋纳(ZiehlNeelsen)法。 口 荧光染料金 胺 O 法(也称金胺 O罗丹明 B 法)。 2.2.1 碱性复红染色法 试 剂 (1)萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5石炭酸溶液 90ml (2)、脱色剂 * 浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 15 - (3)、复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10氢氧化钾 0.1m1 蒸馏水 100ml 染色方法 (1)、涂片经火

25、焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染 5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。 (2)、加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。 (3)、加复染液，染 0.5l min，水洗。 (4)、干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。 *：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用 2硫酸水溶液。 2.2.2、金胺 0 一罗丹明 B 染色法 染剂 1、罗丹明 B 液：罗丹明 B 0.1g 加蒸馏水 100ml： 2、0.1金胺 O 液：金胺 0 0.1g 加蒸馏水 95ml，再加入纯石炭酸 5ml，混匀： 3、 3盐酸酒精； 4、稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液 10ml，加蒸馏

26、水 90ml，混匀。 方法 1、涂片固定后加第 1 液 3090s。 2、弃去第 l 液后加第 2 液染 15min。 3、用第 3 液脱色 l2min，水洗。 4、滴加第 4 液染 30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。 2.3、鞭毛染色 用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。在细菌鉴定中，特别 是非发酵菌的鉴定中很重要。 鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽 量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。菌落应是生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂) 上的过夜培养物。不可采用有抑制剂的选择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS

27、琼脂等。观察 鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及 数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。 鞭毛染色(改良 Ryu 法) 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 16 - 试剂 A 液： 5石炭酸 10ml 鞣酸 2g 饱和硫酸铝钾液 10ml B 液： 结晶紫酒精饱和液 应用液：A 液 10 份，B 液 l 份，混合，室温存放。 染色方法 (1)、玻片的处理：要求用新的载玻片。用前须在 95酒精中浸泡 24 小时以上。用时从 酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。 (2)、在玻片上滴蒸馏水两滴。一张玻片上可同时制 2 个涂片。 (3)、用

28、接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。一般只需 点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。 (4)、玻片置室温自然干燥。 (5)、滴加染液于玻片上，染色。 (6)、约 1015min 后，用蒸馏水缓慢冲去染液。冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液 膜滞留在玻片上，影响镜检。 (7)、玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。寻找细菌较少的视 野，鞭毛容易观察。细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。 2.4、异染颗粒染色 用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。 标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(A1bert)法染色来观察异

29、染颗粒。 试 剂 甲液： 甲苯胺蓝 0.15g 孔雀绿 0.2g 冰醋酸 lml 95乙醇 2ml 蒸馏水 100ml 将各染料先溶于乙醇，然后加入水与冰醋酸的混合液中，充分混匀。静置 24h 后过滤备 用。 乙液： 碘 2g 碘化钾 3g 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 17 - 蒸馏水 300ml 先将碘化钾加少许蒸馏水(约 2m1)，充分振摇，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后， 加蒸馏水至 300ral。 染色方法 (1)、涂片经火焰固定，加甲液，染 35 min。水洗。 (2)、滴加乙液，染 l min。水洗。 (3)、干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。 2.

30、5、墨汁荚膜染色 用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。 传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注 意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。有人用 5黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果较好。 试 剂 印度墨汁或 5黑色素水溶液。 染色方法 将标本与 1 滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。 在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后，转换高倍镜确认。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 18 - 文件 编码 JYK-SOP007 文件 名称 细菌生化反应鉴定及其它试验 操作规程 执行时间 （第四版）

31、 2012.01.01 细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程 1、氧化一发酵试验(OF 试验) 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。可以进行无氧 降解的，称为发酵型(发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的细 菌称为产碱型。 方法：将待检细菌同时穿刺接种两支 HL 培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡(或其它 矿物油)，高度不少于 lcm。35，48 小时或更长。 结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。若 仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者均为氧化

32、 型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。 2、半乳糖苷酶(ONPG)试验 原理：细菌产生半乳糖苷酶分解邻-硝基酚 D半乳糖苷(无色)邻硝基酚(黄色) 结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在 20-30 分钟内显色。 应用：主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。 3、七叶苷分解试验 原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二 价铁离子反应，生成黑色的化合物。 结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。 应用：主要用于 D 群链球菌与其它链球菌的鉴别。前者为阳性，后者为阴性。也可用于 革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。 4甲基红试验 原理：糖代谢分解葡萄糖丙酮酸甲酸、乙

33、酸、乳酸等，加入甲基红。 红色 结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。黄色为阴性。 应用：主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。此外肠杆菌科中变形 杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 19 - 5、VP 试验 原理：分解葡萄糖丙酮酸，脱羧乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，氧化二乙酰，与 精氨酸中的胍基红色化合物。 结果：在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于 35C4h 后仍如故者即为阴性。 应用：本试验与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。 6、吲哚(靛基质)试验

34、 原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸吲哚(靛基质)吲，加入对位二甲基苯甲醛红色玫 瑰吲哚。 结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科的鉴定。 6、尿素分解试验 原理：尿素酶(尿酶)，分解尿素产生大量的氨，培养基变碱。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定，奇异变形杆菌、普通变形杆菌为阳 性，克雷伯菌属、枸椽酸菌属、雷氏普罗威登菌和摩根摩根菌为阳性。 7、苯丙氨酸脱氨酶试验 原理：苯丙氨酸脱氨酶使脱去氨基苯丙酮酸，加入 Fecl3绿色. 结果：出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长会引起退色。 应用：

35、主要用于肠杆菌科的鉴定，变形杆菌属、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性。 肠杆菌科其它菌均为阴性。 8、氨基酸脱羧酶试验 原理：氨基酸脱羧一胺，CO2培养基变碱，黄色紫色。 结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫)为阳性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 9、氧化酶试验 原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。首先使细胞色素 C 氧化一氧化对苯 二氨氧化。粉红色深红色紫黑色 结果：细菌在与试剂接触 10 秒内呈紫色为阳性。为保证结果准确性，应作阴、阳性对照。 应用：主要用于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别，前者为阴性。后者为阳性。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 -

36、 20 - 10、过氧化氢酶试验(触酶试验) 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出 现气泡。 试剂：3过氧化氢溶液 方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加 3过氧化氢数滴；或直接滴加 3过氧 化氢于不含血液的细菌培养基中，立即观察结果。 结果：有大量气泡产生为阳性。不产生气泡为阴性。 应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均阳性。而链球菌均阴性。 1l、硝酸盐还原试验 原理：包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚哨酸盐和氨。再由氨转化为 氨基酸和细菌内其它含氮化合物。二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼 吸酶系统中的受氢体，能使

37、硝酸盐还原的细菌从哨酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其它还原 性产物。 结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色变化反应，可能是硝酸盐没有被还原， 试验阴性。硝酸盐被还原为氨和氮等其它产物而导致假阴性，这时应加入少许锌粉，如出 现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表明为试验为假阴性。 应用：本试验在细菌鉴定中应用广泛。 12、凝固酶试验 原理：致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，可用 玻片法测出。另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，可用试管法测出。 方法：玻片法：取人血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别与血 浆和盐水混合。 试管法：取 2 支试

38、管，各加 05m1 人血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入人血浆 中混匀。于 37水浴 3-4 小时。 结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆 凝固为阳性。 应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。 13、CAMP 试验 原理：B 群链球菌能产生 CAMP 因子，可促进葡萄球菌的 -溶血素溶解红细胞活性， 因此在两菌的交界处溶血力增加。出现矢形(半月形)的溶血区。 结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 21 - 应用：在链球菌中，只有 B 群链球菌 CAMP 试验阳

39、性。 14、O/129 抑菌试验 原理：O/129(二氨基喋啶)对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌无抑制 作用。 方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取 O/129 纸片(含药 40ug)贴于平板上， 35，18-24h，观察结果。 结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药 应用：弧菌属、邻单胞菌属对 O129 敏感，而气单胞菌属耐药 15、杆菌肽试验 原理：A 群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其它链球菌绝大多数对其耐药。 16、奥普托欣试验 原理：几乎所有的肺炎链球菌对 Optochin 敏感，而 Optochin 对其它链球菌则无抑制作用 17、 H2S 试验 原理：有些

40、细菌能分解培养基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)产生硫化氢，硫化 氢遇到铅或亚铁离子，则生成黑色的硫化铅或硫化铁。 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科属或种的鉴定。 18、触酶试验(过氧化氢酶试验) 试剂：3 oAH202 溶液，置棕色瓶内于 4阴暗处保存。 方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加 3过氧化氢溶液 12 滴。静置之，lmin 内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。 19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验 葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。试管法凝 固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因

41、子。 1凝聚因子试验：取 1 滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水 中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合，10s 内观察结果，出现明显 细菌凝块为阳性，否则为阴性。如超过 10s 可出现假阳性，有 10一 15金黄色葡萄球菌呈 假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。 操作过程中的注意点： (1)10s 内观察结果。 (2)必须制备浓厚的均匀菌悬液。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 22 - (3)用 EDTA 抗凝的兔血浆为最好。 (4)加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。 (5)生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。 2

42、葡萄球菌凝固酶试验：用生理盐水将血浆 4 倍稀释，取 05ml。然后挑取 35 个菌 落于稀释血浆中，成浓菌悬液。置 37水浴，34h 后读取结果，凝固者为阳性。若阴性， 继续观察到 24h，不凝固者为阴性。试验应同时作阳性、阴性对照。 试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维 状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育，才 可出现阳性。凝固酶试验应考虑下述情况： 某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。 所用血浆缺乏纤维蛋白原。 试验菌株不纯。 20、新生霉素耐药试验 方法：挑取待检菌菌落数个，制成相当 0.

43、5 号麦氏管(McFarland)浓度菌液，棉拭子浸 透，挤去多余液，均匀涂在 MH 平板上，贴上含 5ug片的新生霉素纸片，35孵育 1620h，抑菌环直径16 为阳性(耐药)。试验时应以金黄色葡萄球菌 ATCC25923 做阴性(敏 感)对照，以确认纸片是否有效。 21、氧化酶(改良法)试验 试剂： 四甲基对苯二胺(TMPD) (Tetramethylphenylenediamine) 6.0g 二甲基亚砜(DMSO) (Dimethy sulfoxide) 100.oml 溶解 TMPD 于 DMSO 中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。 方法：被检菌株移种于 7羊血琼脂上，3

44、0需氧条件下孵育 1518h，刮取菌落涂布于 无色滤纸片上，加 l 滴上述试剂，阳性者在 2min 内呈深蓝色。 若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育 3 天以上，才可检测，阳性反应 510min 出现。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 23 - 文件 编码 JYK-SOP008 文件 名称 细菌的接种与培养方法操作规程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 细菌的接种与培养方法操作规程 一、细菌的接种 根据待检标本的来源、培养目的及所用培养基的性状，采用不同的接种方法。 l、平板画线分离法 （1） 、连续画线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。用接种环取标本

45、少许，于平板 l/5 处密集涂布，然后回来作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离，划满平板为止。 （2） 、分区画线分离法此法适用于杂菌较多的标本。先将标本均匀涂布于平板边缘一小 区 (约占平板 1/5)，再在二、三区依次连续画线，每画线一区均将接种针灭菌一次。每一区 的划线均接触上一区的接种线 12 次。以获得单个菌落。 2、斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养。用灭菌接种环取菌少许，从培养基斜面底部向上划一 直线，然后从底部向上作连续曲线画线。一直画到斜面顶端。 3、液体接种法 多用于一些液体生化试验管的接种。用灭菌接种环取菌少许，在试管内壁与液面交接处 的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于

46、液体中。 4、穿刺接种法 主要用于半固体培养基、明胶及双糖铁的接种。用接种针取菌少许，从半固体培养基中 央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针原路退出。 5、倾注平板法 临床上主要用于尿液等标本的细菌计数。将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌的 平皿内，倾入已经溶化并冷却至 45左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。 6、涂布接种法 常用于纸片药物敏感性测定，也可用于被检标本的细菌计数。加定量的被检菌液于琼脂 平板表面，然后用灭菌的 L 型玻璃棒反复涂布几次，使被检菌均匀分布在琼脂平板表面。然 后贴上药敏纸片培养，或直接培养观察结果。 二、细菌培养方法 内江市第六人

47、民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 24 - 根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同的环境进行培养。常用的有需氧培养 法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。 1、需氧培养法 本法是临床细菌室常用的培养方法，即将已经接种好的平板、斜面和液体培养基等。置 于 35温箱中孵育 1824 小时。 2、二氧化碳培养法 本室用 Co2 孵箱将已接种好的培养基置于 Co2 孵箱内培养。 3、厌氧培养(暂时未开展) 三、分离及纯化法 3.1、分离是指从原材料或多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地分离开，以得 到纯的单一菌株，技术步骤如下： 作纯培养分离时，一般只用一只完整的琼脂平板。涂划多采用分区划线

48、法，在一只平板 中可划 35 个区。划法有两种： 3.2、从临床标本分离细菌所含菌数相对较少时，可用接种环取标本涂布在平板一角边缘， 然后从此区开始划线至 13 平板，为第一区，再在 2、3 区依次划线，每划完一个区域均将 接种环灭菌一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线均接触上一区域的接种线 12 次， 使菌量逐渐减少以获得单个菌落。 3.3、快速划线分离法：采用快速划线使一接种环标本能分离出单个菌落，这与标本的菌 量及操作者的技能有很大关系。 3.4、纯化是指欲获得大量纯培养物的方法，所用平板大小可根据需要的菌量而定。方法 是将一单个菌落或将相同的菌落作大量密集涂划于平板上而获得大量纯的

49、培养物。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 25 - 文件 编码 JYK-SOP009 文件 名称 支原体培养、鉴定、计数及药敏 操作规程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 支原体培养、鉴定操作规程 1原理及依据标准： 支原体分离鉴定培养基用于泌尿生殖道支原体(解脲支原体 Uu 和人型支原体肺)的检测与 诊断。当有 Uu 和 Mh 生长，分解尿素和精氨酸引起 PH 上升，使以酚红为指示剂的培养基由 黄转红。依据珠海迪尔生物工程有限公司生产的试剂盒说明书。 2标本的采集： 2.1、男性：用特别细的无菌棉拭子沾取无菌生理盐水少许深入尿道口内 225cm 处取 分泌物，前列

50、腺液亦可用沾取无菌生理盐水的无菌棉拭子尽量多的沾取。 2.2、女性：用沾取少许无菌生理盐水的棉拭子取宫颈内口 12cm 处单层柱状上皮细胞， 取样拭子不可碰阴道壁。 2.3、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应接种运输培养基送检：将已采样的拭子放 置入运输培养基小瓶内，搅动数次后将拭子于瓶壁上尽量旋转挤压其中的液体，取出拭子并 盖上瓶塞。支原体在此培养基中放置室温可保存 8 小时。在 4条件下可保存 24 小时。中段 尿标本可直接送检。 2.4、整个采样过程应注意无菌操作。若送检标本不是接种运输培养基而直接用采样棉拭 子送检则为不合格标本。随原验单一同退回重新采取标本同时在检验系统“标本留言”

51、栏注 明以免收其费。 3、标本接种：(本实验应注意无菌操作，避免污染杂菌) 3.1、取出培养基，放置接近室温，并在瓶盖上编号。 3.2、将采集的标本拭子插入培养瓶中，在靠近液面上方的瓶壁挤示压旋转拭子数次，使 拭子中标本渗入到肉汤中：若为液体标本，取 200 u 1 加入培养基中；若为中段尿，经 2000 转分离心 10 分钟取沉渣 100ul 加入培养基中。 3.3、盖上瓶盖，置 3537孵箱，在 2448 小时分别观察结果。 4、结果判读： 4.1、培养基变红，判断阳性，培养基黄色并清亮，判断阴性。 24 小时结果： 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 26 - 5已检标本处

52、理：密闭容器高压灭菌后，按医用垃圾处理。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 27 - 文件 编码 JYK-SOP010 文件 名称 血液感染病原体检验操作规程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 血液感染病原体检验操作规程 1、标本采集 (1)、采集时间和次数血标本一般应在病人发热初期或根据不同的发热情况在未用抗生素 前采集做细菌培养，提高阳性率需连续三次采血进行培养。 (2)、采血部位及抽血量一般抽取肘静脉血。采血量为成人 5-10ml，儿童为 35ml。 (3)、结果观察：培养 72 小时后若肉眼或自动血液培养仪报告仍未细菌生长，则盲目移 种一次，仍未细菌生长，向临

53、床发出一级初级报告：“血液经 72 小时培养无细菌生长”：为 避免漏诊，应在培养 5 天、7 天时再作盲目移种培养。疑为亚急性细菌性心内膜炎、真菌血 症等时，血培养至少连续培养 23 周，仍无细菌生长方可报告为阴性。 2、检验程序 血液标本（无菌采集） 72 小时盲目移种 （初级报告） 传统方法或自动血液培养仪指示有细菌生长 涂片、染色、镜检 需氧培养及 CO2培养 直接药敏试验 （血平板、巧克力琼脂） 观察菌落 涂片、染色、镜检 纯培养 血清学鉴定 ATB Expression 报告 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 28 - 3、血培养瓶中不同表现为不同细菌生长： 浑浊并有

54、凝无块 金黄色葡萄球菌 均匀浑浊，发酵葡萄糖产气 多为革兰阴性菌 微浑浊，有绿色变化 肺炎链球菌 表面有菌膜，培养基清晰，底层容血 枯草杆菌 表面有菌膜，膜下有绿色浑浊 铜绿假单胞菌 血细胞层上面有颗粒状生长，自上而下的溶血 溶血性链球菌 4、血液及骨髓标本中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 表皮葡萄球菌 变形杆菌 溶血性链球菌 产气肠杆菌 粪肠球菌 肺炎克雷伯氏菌 铜绿假单胞菌 粪产硷杆菌 沙雷氏菌 流感嗜血杆菌 布鲁氏菌 5、报告结果 5.1、在血液中检出沙门氏菌，必须以血清凝集试验为依据报告血清型。 5.2、血液正常情况下应是无

55、菌的，如培养出细菌即为致病菌，应报细菌的种属及药敏试 验结果。 5.3、血培养阳性均作为危急值报告。 内江市第六人民医院检验科 细菌室操作程序文件 - 29 - 文件 编码 JYK-SOP011 文件 名称 中枢神经系统感染病原体检验 操作规程 执行时间 （第四版） 2012.01.01 中枢神经系统感染病原体检验操作规程 l、标本采集 以无菌方法采集脑脊液 25ml，盛于无菌瓶中送检。 2、直接检查 脑脊液可直接涂片、革兰染色或抗酸染色等，然后镜检。无色透明的脑脊 液，应作离心取沉淀物涂片、染色镜检。 3、检验步骤： 3.1、一般细菌涂片检查除结核性脑膜炎外，由其它细菌引起的化脓性脑膜炎，脑脊液明 显混浊，可直接涂片，革兰染色镜检。无色透明的脑脊液，应离心后涂片、染色、镜检，根 据染色及形态特征可初步提示细菌的种类。结核分枝杆菌涂片检查：取脑脊液的离心沉淀物 (3000rmin。30min)作抗酸染色。新型隐球菌涂片检查：取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染 色。 3.2、分离培养用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血平板、巧 克力平板，巧克力平板应置于 CO2环境中 35培养 1824 小时。脑脊液也可直接注入血培 养瓶。 4、检验程序 脑脊液 直接涂片 分离培养 （取离心沉淀） 不染色标本 染色标本 血平