大肠杆菌计数

1、大肠杆菌计数,严纪文,广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5发酵乳糖产酸产气、 IMViC生化试验 (靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)为+ + - -或- + - -的革兰阴性杆菌。,大肠杆菌的定义,大肠杆菌的某些菌株对人有致病性。 相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌与粪便污染的相关性最好，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年 。 为什么后来又有了大肠菌群和粪大肠菌群的应用？主要的原因是因为大肠杆菌的检验过于复杂。 大肠杆菌是用于评价食品近期受到粪便污染的指标。 随着食品卫生标准的日益科学和细化，以及对大肠杆菌检验方法的不断改进，对特定食

2、品的大肠杆菌的检验需求肯定会越来越多，因此在本次标准修订时增加了大肠杆菌计数方法。,卫生学意义,大肠杆菌计数,第一法：MPN法 第二法： VRBA-MUG平板计数法 第三法：Petrifilm测试片法,第一法 大肠杆菌计数MPN法,大肠杆菌计数MPN法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍稀释,选择3个连续稀释度样品匀液接种LST,482h,361,不产气,产气,EC肉汤,450.2,242h,不产气,产气,EMB琼脂平板,361,242h,营养琼脂斜面培养,I M Vi C生化试验，革兰染色,查MPN表，报告,初发酵,选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择

3、原液）。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1 mL，则用双料LST肉汤）。361培养48h2h，如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。,复发酵,如有产气者，则转接到已提前预温至45的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放于带盖的44.50.2水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h2h，如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。,分离培养与纯化,如有产气者，则分别划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，361培养24h2h后检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 挑选典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌

4、落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，进行进一步的纯化分离。,生化鉴定,取培养物进行革兰氏染色和生化试验。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。 查MPN表，报告每g（mL）样品中大肠杆菌MPN值。,大肠杆菌与非大肠杆菌 的生化鉴别,注：如果是出现了这个表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应该重新划线分离，必要时需要重复试验。,EMB琼脂,主要成分：乳糖、营养物质。指示剂系统：伊红和美监。 原理：大肠菌群分解乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者的比例有关。 不发酵乳糖产酸的细

5、菌，在碱性环境中不能使伊红、美蓝结合，因而形成无色的菌落。 部分大肠菌群的菌株在EMB上可形成红色或粉红色的菌落。（应注意非典型的菌落）。,EMB琼脂上大肠杆菌的典型菌与可疑菌落,典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。 非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心,生化鉴定的注意要点,靛基质试验：361，24h 2h； 甲基红试验：361，4d；滴加甲基红试剂，出现红色为阳性；出现黄色为阴性结果。 V-P试验： 361，48h 2h；滴加试剂后若未出现伊红色，应再培养2h后再观察结果。 柠檬酸盐试验： 361，96h 2h；观察有无细菌生长。有细菌生长培养基可变为蓝色。,第二法 VRBA-MUG平板计

6、数法,制订依据,美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria,基本原理,4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷，英文缩写 MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠杆菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠杆菌阳性。MUG对大肠杆菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。,VRBA-

7、MUG平板计数法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释度的样液， 接种VRBA-MUG平板,紫外光下，计数发荧光的菌落,报告结果,361,1824h,检验,选取23个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1mL注入两个无菌平皿。 另取1mL样品稀释液注入一无菌平皿中，作空白对照。 将预热至45士0.5的结晶紫中性红胆盐琼脂10 mL15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。 待琼脂凝固后，再加3 mL4mL VRB-MUG覆盖平板表层。 凝固后翻转平板，361培养18 h24h。 注：空白对照不加VRB-MUG覆

8、盖。,大肠杆菌平板计数与报告,选择菌落数为10100的平板，暗室中360nm366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。 两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以cfu/g(mL)表示。,注意事项,在实验时要用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照。 在选择计数平板时，选择的菌落数不要太多太密，50个左右效果比较好些。原因是游离的4-甲基伞形酮有水溶性，能从菌落向培养基中扩散，菌落太多的话，尤其是阳性菌落太多时，很可能因荧光扩散，造成较大的误差。 紫外灯的功率不要太大。功率大

9、了需要做好个人防护。,第三法 PetrifilmTM测试片法,基本原理,PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB培养基，冷水可溶性凝胶和葡萄糖苷酶指示剂，可增强菌落计数效果。E .coli能产生-葡萄糖苷酸酶与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围。表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后计数蓝点带气泡的菌落即为大肠杆菌数，红点带气泡和蓝点带气泡的菌落之和为大肠菌群数。,大肠杆菌PetrifilmTM测试片检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释度的样液， 接种

10、PetrifilmTM大肠杆菌测试纸片,计数蓝色带气泡菌落,报告结果,361,242h或482h,操作要点,合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片； 接种时将纸片置于平坦在实验台，接种后将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生； 培养基未凝固时勿挪动； 对于肉、家禽和水产品，培养时间为24h2h,对于其它产品，培养时间为48h2h。 培养时纸片堆叠不要超过20片。,结果判读,大肠杆菌为蓝点带气泡的菌落； 不论蓝色深浅，部分蓝色带气泡的菌落均为大肠杆菌； 圆形边缘上及边缘外的菌落不计数； 注意样液菌量高的几种情况； 蓝点带气泡菌落和红点带气泡菌落之和为大肠菌群数。,大肠杆菌测试片的计数与结果报告,选取菌落数在15150之间的测试片作为计数标准。 选择菌落数在15150之间的稀释度，平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以()1乘以最低稀释倍数报告之。,如果最高稀