API使用培训.ppt

1、API系统 -构成: 试条由特別选择的生化反应小管 API试条有多种类 各有相应的数据库 所有生化结果以同时间一并阅读,API系统 试条由10, 20, 50.测试组成不等 结果：鉴定百分率 基本单位：条目（Taxa)- 种(Pseudomonas Aeruginosa)- 生物型号(E. Coli 1)- 属(Salmonella Spp.)- 一群菌种(Aeromonas hydrophilia/cavicie) 所引用的分类学跟国际认可的一样- International Journal of Systematic Bacteriology 资料库整个系统的心脏,API资料库，不断更新，

2、跟据 - 分类学的进化 - 新的菌种 - 生化反应的演进 - 鉴定菌种需要的改变,优点： -标准化，简易化 -在制造过程中，进行质控 -FDA标准 -用家可用ATCC菌种进行质控 -系统化 -操作简易 -快速报告 -20年经验，拥有菌种资料25000，鉴定系统的发源生化测试750 -1500文献,與不同国家地區的权威机构交流 美国 日本 澳大利亞 欧洲,API鉴定范围 庞大资料库 15种试条 550种细菌可被鉴定 研究用试条：乳酸杆菌，芽胞菌，变曲菌 简单方便 以同一基础概念运用 标准化方法 快速结果 4-24小时 降低成本 成品化，单一化试剂 简单判读结果,选条的标准,革兰氏阴性杆菌分类,氧

3、化酶 +,氧化酶 -,革兰氏阳性杆菌分类,触酶 -,触酶 +,短小脱色含有异染颗粒 slight discoloration (granulations),短球杆菌,延长状杆菌,细小不透光菌落,20-25C 有动力 37C 无动力,大体积产芽孢杆菌,革兰氏阳性球菌分类,触酶 -,触酶 +,金黄色萄葡球菌,溶血,+,-,定向试验,-在细菌学里最普遍的染色方法,革兰氏染色,步骤,G(),G(),- 染色前，所有细胞是透明的,- 结晶紫着色後用碘增加染料与菌体结合,- 乙醇从G() 菌体洗脱结晶紫,- 用番红液复染，革兰氏阴性菌呈粉红色，革兰氏阳性菌呈兰紫色,Color Gram 2 革兰氏染色剂,

4、即可用试剂 - R1 = 草酸盐 - 结晶紫溶液 - R2 = 稳定化卢哥氏 - PVP液 - R3 = 脱色剂 - R4 = 番红液 技术要点 - 使用新鲜培养细菌 (24-48小时) - 脱色过度会使G+菌染成G-,Color Gram 2 染色剂,试剂组成 R1 = 240 ml x 1 R2 = 240 ml x 1 R3 = 240 ml x 1 R4 = 240 ml x 1 所有试剂瓶带滴咀 于18-25C储存,革兰氏染色液 2 (Color Gram 2),- 特性 稳定化的碘液 PVP(聚氯乙烯吡咯烷酮)可以防止因碘挥发而变质，同时也增强了媒染效果。 更容易分别G()及G(-

5、)菌 高质量的结晶紫和番红，无沉淀。,接解酶试剂,- 原 理,- 传统方法,H2O2,2H2O + O2,接 解 酶,玻片法,试管法,接触酶试剂,容许于平板(包括血平板)上作直接检测,组成: - 增稠剂: 高粘度集中所产生的气泡, 防止试剂扩散 - Evans兰: 兰色使结果更容易阅读 - 3%H2O2,- 玻片法 - 直接在平板上测试,接触酶检测试剂,接触酶试验是细菌鉴定中的一个重要反应。由于传统方法的易产生假阳性结果，这个试验没有得到充分应用。,ID Color Catalase,产品规格,氧化酶试验,- 原 理 :,TMPD,氧化 TMPD,氧 化 酶,(TMPD = 2甲基一对一苯撑二

6、胺),货号: 55922 纸片:浸泡饱和TMPD 储存: 2-8C于暗处 有效期: 1年 组成: 2x30片小瓶装, 纸片,货号: 70460 储存: 2-30C于暗处 组成: 1个小瓶, 液体试剂,(深紫色),(透明),氧化酶纸片法,液体 氧化酶试剂,试剂方法: - 用2个试管载1-2ml无菌水 - 第一管为阴性对照: 加一滴OX试剂 - 第二管为测试管: 加可疑菌落然后再加二滴OX试剂 - 比较二支管的颜色: 阴性对照: 透明, 浅紫色 结果: OX(-) : 透明,浅紫色 OX(+): 紫色, 深紫色,生化鉴定,容易使用,API结果 原理： -生化结果组合跟资料库內的典型条目(Taxa)

7、作出比较 -经计算後， 鉴定百比率（%Id）机会率，指示出不同菌类的比较 T值（T index）=指示出在同一個菌类的相似程度,生化鉴定,可靠及具创意的选择,最典型 生化普,菌种 X,T 值,资料库,生化结果 (菌种 X),(菌種X),API结果 跟据T值及%Id的组合，作出评语： (i)Excellent Identification %Id 99.9及T0.75 (ii)Very good Identification %Id 99.9及T0.75 (iii)Good Identification %Id 90.9及T0.25 (iv)Acceptable Identification %

8、Id 80.0及T0 (v)Doubtful profile其中一个生化反应出现严重违反典型生化结果,API 20E / Rapid 20E - 肠道杆菌科细菌在环境中及动物产品中非常普遍，其中部份 (沙门氏、耶尔森氏)是致病菌 -API 20E是常规鉴定中的标准 -其他新鉴定系统比较的金标准 -方便使用，4或24小时出报告,API 20E试剂条接种要点,先做氧化酶试验，氧化酶为阴性时接种API 20E,氧化酶为阳性时接种API 20NE试剂条 塑料培养盒中加水5 ml,放入试剂条，记录标本资料。 取1个1mm 大小，1824hr菌龄的菌落，分散于5ml悬浮液（20150）中，使达0.5 Ma

9、c Farland 浊度。 小心沿内壁加菌悬液到微量生化杯中。其中：有U形框标记的项目(CIT、VP、GEL)，将菌液加满；有下划线标记的(ADH、LDH、ODC、H2S、URE、)，加好菌悬液后，用无菌液体石蜡封口。 剩余的菌液可用于涂玻片、染色，接种于非选择性平板做次代培养。 盖好孵育盒盖，放置几分钟，观察每个微量杯都应呈阴性反应的颜色。 孵育盒放入37摄氏度温箱培养24小时。,API 20E反应结果阅读要领（）,一、若GLU（葡萄糖）为阳性，则记录GLU的结果，在TDA、IND、VP孔中加入相应的附加试剂，1分钟内读取TDA、IND的结果，510分钟内读取VP的结果。同时读并记录取其它反

10、应的结果，用生化鉴定结果组成一个7位数编码。 二、若GLU(葡萄糖)为阴性，但有多于2个的反应呈阳性，则按上述方法读取并记录结果。 三、若GLU（葡萄糖）为阴性（非发酵菌），且其它呈阳性的反应不多于2个，则不要加试剂，放回温箱中再培养 24 hr后按第一条的方法读取结果。同时用次代培养物接种2个API OF培养基证实葡萄糖代谢类型；接种1个API M培养基观察动力；划线接种MacConkey平板。培养24hr后将其结果记录到API 20E报告单，与生化鉴定结果一起得到一个9位数编码。,API 20E反应结果阅读要领（）,ONPG：淡黄色黄色为阳性，无色为阴性。 ADH、LDC、ODC、URE以

11、苯酚红为指示剂，橙色红色为阳性，黄色为阴性。 CIT：管口处出现兰色为阳性，黄色绿色为阴性。 H2S：黑色为阳性，无色浅灰色为阴性。 TDA、IND、VP加试剂后出现红色为阳性,不出现红色为阴性。 GEL：黑色素扩散为阳性，不扩散为阴性。 GLUARA为糖类的酸化反应，指示剂溴百里香酚兰显黄色为阳性，蓝、绿色为阴性。,GLU为阴性时，记录其结果，并在GLU孔中按先后顺序分别加一滴NIT 1和NIT 2试剂，出现红色时 NO2为阳性，N2为阴性；不出现红色时，加少许Zn粉，此时出现红色，则NO2为阴性，N2为阳性。 有动力，MOB为阳性，无动力则为阴性。 麦康凯平板上生长，McC为阳性，不生长为

12、阴性 OF培养管下部变色为发酵型，OF-F为阳性，下部不变色OF-F为阴性；OF培养管上部变色为发酵型，OF-O为阳性，上部不变色OF-O为阴性,API 20E反应结果阅读要领（）,Rapid 20E 技术要点,(i)试条阅读 a) LDC - ODC: 兰色为阳性结果 - 切记加石蜡油 (因接种孔太小) - 因pH指示剂跟API 20E不同，切勿混乱 b) IND - 3分钟内阅读 (ii)不适用于非发酵菌 (iii)用新鲜培养: 24小时 (iv)最好在营养琼脂上挑菌落 (v)用0.85%NaCl盐水加速细菌生长 (vi)CIT 孔较易出现假阴/阳性结果 (vii)最多只能培养5小时否则P

13、PA, URE 及 ODC出现假阳性 (viii)不要经常开关培养箱 (ix)不需潮湿环境,API 20NE -非发酵G(-)杆菌存在于空气、水及表面 -部份细菌（如绿脓假单胞菌）为致病菌 -试条主要由传统生化反应及同化反应小管 所组成 -64条目(Taxa) -非发酵G(-)杆菌的标准鉴定方法,API 20NE试剂条接种要点（1）,先做氧化酶试验，阳性者接种API 20NE。 塑料培养盒中加水5 ml,放入试剂条，记录标本资料。 取1824hr菌龄的菌落，分散于ml盐水（20040）中，使达0.5 MacFarland 浊度（A液）。 取A液200 ul(滴），加入AUX培养液中，小心混匀避

14、免产生气泡，制成同化试验接种液（B液）。 用A液按API 20E相同的方法接种生化试验杯孔（NO3PNPG其中，GLU，ADH,URE用液体石蜡封口）,用B液接种同化试验杯孔(下面有三条红线者）。使液面与杯口平齐B液黏度很大，特别注意不要使菌悬液堵住杯口，形成大的气泡，影响反应结果。 严格无菌操作，避免空气中的杂菌污染同化试验 剩余的A液可用于涂玻片、染色，接种于非选择性平板做次代培养。 盖好孵育盒盖，放置几分钟，观察每个微量杯都应呈阴性反应的颜色。 孵育盒放入30摄氏度温箱培养24小时。,API 20NE试剂条接种要点（2）,API 20NE 技术要点,同化试验项目接种要求,- 接种液面与杯

15、口平齐，太多或不足会造成错误结果。,API 20NE反应结果阅读要领（）,一生化试验： 不要打开塑料培养盒盖，先读取从GLU到PNPG的生化试验结果并记录之 在NO3杯孔中按先后次序分别加入一滴NIT1和NIT2试剂，出现红色NO3为阳性不出现红色时，加少许Zn粉，此时出现红色，则NO3为阴性，分钟内不出现红色，则NO3阳性 TPR杯孔中加一滴James试剂，立即出现红色为阳性不出现红色为阴性 二同化试验： 从杯口上方往下看，红线模糊或菌悬液变浑浊，表明有菌生长，为阳性否则，为阴性 偶有弱生长者可记录为或,三在报告单上做出一个位数编码，查编码手册或API LAB软件 四如果，查不到编码，或给出

16、提示“IDENTIFICATION NOT VALID BEFORE 48-HR INCUBATION”,立即用液体石蜡将NO3和TRP封口继续培养小时,再读结果而NO3 和TRP要记录培养24小时的结果,API 20NE反应结果阅读要领（）,API STAPH -凝固酶阴性葡萄球菌于环境污染中常见 -其中以金黃葡萄球菌为代表 -以Kloos and Schleifer Classification为基础 -试条由传统方法及发酵反应小管组成 -22个条目(葡萄球菌及微球菌),API STAPH 技术要点,(i)附加试验 第21 - 溶葡萄球菌素 (lysostaphin，LSTR) 用纸片法做

17、 目的: 确认微球菌 经常抗药 (+) 其他葡萄球菌 LSTR (-) (ii)阅读结果 (发酵试验) PH指示剂: Phenol Red(酚红) 阳性: 红变黄 - 阴性对照: 小杯 O - 阳性对照:小杯 GLU (葡萄球菌均阳性) 橙色结果: - 在2个阳性中间: 阴性结果 - 在2个阴性中间: 阳性结果 - 在小管(红色)底部出现黄或橙: 阳性结果,API 20A,- 厌氧菌常存在于与氧气隔绝的标本中，如罐装食品 - 常见的有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌 - 厌氧菌需要特殊的培养条件 1）厌氧环境（45534、96127、96124、96118） 2）高营养(含血43041)、具还原性的培养

18、基（41936) - 可鉴定G-、G+球菌及杆菌86种 - 厌氧菌鉴定的标准方法,API 20A接种要领,尽快接种，减少暴露在空气中的时间 一定要将分离平板上的单个菌落用含血平板做次代纯培养。 取纯培养物小心分散于20A Medium,使菌悬液浊度达3 MacFarland，避免产生气泡。 IND ARA 、ESC TRE接满管部，GEL接满至杯口。 IND液体石蜡封口。 37摄氏度、厌氧、保湿培养24hr,API Listeria -单核细胞增生李斯特氏菌是唯一致病菌 -用于食物卫生控制 -李斯特氏菌的鉴定标准 -唯一能鉴定所有李斯特氏菌的方法 -6个条目(Taxa),API Listeria 技术要点,(i)- DIM试验 (梅里埃独有) : 分辩英诺加及