固定化酶及固定化技术PPT演示课件

第五章固定化酶及固定化技术,酶：,在水溶液中不稳定一次性使用-难回收，难连续化生产用于医药/化学分析纯度要求高产物的分离纯化困难。要求将酶变成不溶性实际上将酶限制在一定空间固定化,固定酶具有催化活性,1916年，美国科学家发现，酶和载体结合以后，在水中呈不溶解状态时，仍然具有生物催化活性。,固定化酶可重复使用操作稳定性酶在固定化后其活力可以缓慢释放,酶的稳定性比天然状态高,可重复多次使用.,结果如图所示:固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15%,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性,例:将0.5gDEAE纤维素固定化壳聚糖酶与10mL1%壳聚糖溶液在60下连续反应10次每次反应时间为6h每次反应后分别测定酶活力,一、固定化酶（immobilizedenzyme）,水溶性酶,水不溶性载体,固定化技术,水不溶性酶（固定化酶）,什么是固定化酶？,固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋等多种方法。,与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器,同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和pH等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。,酶生物反应器,简史,1916年，Nelson载体的影响：在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。载体与酶的相互作用：载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位等。,改变之一：构象改变、立体屏蔽,构象改变：酶分子构象发生某种扭曲，导致酶与底物结合能力或催化能力下降立体屏蔽：固定化后，使得酶的活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使得效应物或者底物与酶的临近或者接触受到干扰,改变之二：分配效应、扩散限制,微环境：微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。分配效应：由于载体性质，造成底物和效应物等在微观体系和宏观体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度,扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环境中的迁移运转速度收到限制,DEAE纤维素固定化壳聚糖酶:以DEAE纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶,改变之三：微扰,由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质,直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力,1.固定化后酶活力的变化,固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。例如：用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物：酪蛋白（高分子）原酶活力的30%苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺(低分子)原酶活力的80%。,一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。,原因：酶结构的变化空间位阻,不过，也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。,在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接近。,Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现：30种酶稳定性提高，12种酶无变化，8种酶稳定性降低。然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。,2.固定化对酶稳定性的影响,固定化后酶稳定性提高的原因,可能有以下几点：固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解,固定化青霉素酰化酶将酶于0.05molL的PBS（pH7.5）中分别在不同温度下保温6小时，冷却后测定酶活力。固定化酶的热稳定性优于自然酶。,固定化酶的稳定性变化固定化酶；2.自然酶,a.热稳定性提高,测试结果:5天后其活性仍可保留96%.,例:将DEAE纤维素固定化壳聚糖酶浸泡在95%的乙醇中，连续5天测其催化活性,b.对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高,提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。提高酶对某些抑制剂的稳定性可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。,c.对pH的稳定性提高,青霉素酰化酶在不同pH值的缓冲液中，于37保温16h测定酶活力。固定化酶在pH5.5-10.3活力稳定；游离酶则仅在pH7.0-9.0稳定。固定化酶的pH稳定性明显优于游离酶。,d.对蛋白质水解酶的抗性,固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用,并在空间上阻碍酶与大分子物质接近,从而降低了酶与大分子物质结合的几率,防止酶被其他蛋白酶水解.,此外：,有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120天酶活力无变化。,对操作稳定性都有影响,如图：固定化酶的最适温度为60C，而游离酶的最适温度为50C而固定化酶在50-65C范围内都保持了较高的酶活力,这说明壳聚酶经固定化后其在较高温度下的适应范围有了明显提高,3.固定化酶的最适温度的变化,固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化酶的最适温度提高,当然，也有报道最适温度不变或下降的。,4.最适pH值的变化,酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH和pH-活性曲线常常发生偏移。,pH对固定化酶的影响,1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。,（2）产物性质对体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH值；反之则低,例:取0.2gDEAE纤维素固定化壳聚糖酶与5mL壳聚糖酶液各8份分别于不同pH下测定固定化酶和游离酶的活力,可见：固定化酶的最适pH向酸性偏移,例：取0.15g固定化黄曲霉毒素解毒酶和4ML黄曲霉毒素解毒酶液各8份，分别于不同pH下测定固定化酶和游离酶的活力,可见：固定化酶的最适pH向碱性偏移,影响固定化酶Km的因素：1.酶的空间立体障碍载体为电中性时，由于扩散限制造成表观Km上升。2.电荷效应（1）载体与底物带相同电荷，KmKm（2）载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm3.溶液的离子强度,5.固定化酶的米氏常数（Km）变化,例：取DEAE纤维素固定化壳聚糖酶0.2g与1%壳聚糖酶液5mL各6份分别加入2mL不同浓度的壳聚糖溶液(0.4%1.5%)于50C水浴中保温60min测定还原糖浓度，用双倒数作图求得米氏常数如图：经线性拟合可求得Km(固)=18.87g/LKm(游)=2.49g/L,本实验中选用的载体DEAE纤维素和底物壳聚糖所带电荷相反使得Km值降低；酶固定化后产生的空间立体障碍或扩散阻力使得Km值升高,从实验结果可以得出固定化过程中载体所带的电荷的极性对本实验室所提取的壳聚糖酶的米氏常数的影响较酶经固定化后所产生的空间扩散阻力对酶的米氏常数的影响小，所以最后酶Km提高。,五、评价固定化酶的指标,一般评价：1酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。2.酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶活力单位,固定化酶,1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）,3.偶联效率以载体结合酶量(或酶活力)的百分数表示：,由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。,4.活力回收酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收率,。,5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力,六、固定化细胞,利用胞内酶制作固定化酶时，需要破碎细胞，然后提取酶，这就增加了工序和成本。科学家设想直接固定含所需胞内酶的细胞固定化细胞与固定化酶比较，其优越性在于：保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生。,20世纪70年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于生产。例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以用于酒类的发酵生产固定化增殖细胞发酵更具有显著优越性,固定化细胞分类、形态特征和生理状态：,形态特征：,固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相同）等，目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为：不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是柱反应器内易受压变形，流速不好，圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所以生产效率相对较高。,细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化。但是，扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现象。无论用海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶包埋，都有类似情况。形成“凹池”的原因尚待进一步研究。,固定化死细胞：一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。,固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。,固定化增殖细胞又称固定化生长细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。,与固定化酶和固定化死细胞比较,固定化增殖细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定，因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不解体，不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应，所以说，固定化增殖细胞在发酵工业中最有发展前途。,固定化增殖细胞发酵的优越性,1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。(膜的选择通透性）4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应5、抗污染能力强,固定化细胞技术的局限性：,(1)必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用,载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性.(4)如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；但这些缺点并不影响它的实用价值。,固定化酶与细胞的选择依据：,对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂。要根据过程本身来决定。一般说:对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适。对多步转换，采用整细胞显然有利。,缺点：固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降,固定化微生物和动植物细胞的应用,固定化微生物细胞：用于生产酒类、氨基酸、有机酸、抗生素以及酶和辅酶，也可以用于有机溶剂生产，废水处理等固定化植物细胞：主要用于生产人工种子、香精、色素、药物、酶等固定化动物细胞主要用于生产疫苗,七、固定化酶的应用,1、在工业上的应用用固定化酶可以生产L-氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、半合成的抗生素母核等L氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分DL氨基酸可连续生产L氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）生产LAsp：以120L柱式反应器60天可生产5吨的LAsp。,乙酰-DL-AlaL-Ala+乙酸乙酰-DAla（A-D-Ala）,Aminoacylase氨基酰化酶,固定化酶用于水解牛奶中的乳糖,牛奶中含有43-45的乳糖，乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后将导致不良后果。用乳糖酶可以将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋类产品中结晶改善口感。,严重肾脏疾病，需血液透析。过滤尿素和尿酸等代谢废物利用固定化脲酶透析液和活性碳构成的体外循环装置固定化脲酶：脲酶与离子交换树脂通过微囊法制备而成的脲酶水解尿素为氨和CO2，氨被树脂吸附，CO2由肺呼出，其他代谢物由活性碳吸附,2.在医药治疗上的应用,人工肾：,治疗癌症,正常细胞：L-Asn合成酶，Asn被消耗的同时不断合成维持细胞蛋白质合成需要癌细胞：缺少活无L-Asn合成酶，Asn被消耗，影响蛋白质合成，细胞“饿死”,用固定化的天冬酰胺酶治疗白血病,利用尼龙或尿素聚合物半透膜制备成微囊型L-天冬酰胺酶,用于白血病治疗。改变了酶的最适pH；微囊型酶对蛋白酶稳定；注射到大白鼠腹腔内，急性毒性很低、也不会产生抗体；除制成微囊型外，还有人采用酶管或酶板形式进行体外循环治疗，也达到了预期的疗效。,微囊型固定化酶,将酶包埋在半透膜性质的聚合物内，制成所谓的微囊型固定化酶。小分子底物或产物可自由地透过胶囊的半透膜，而酶作为大分子则不能透过胶囊；此外，胶囊外的一些蛋白质、酶、抗体等高分子物质也不能进入胶囊内部，这就避免了发生过敏性反应。,胶囊型固定化酶的另一大优点是，胶囊内的酶仍以溶解状态作用于底物。因此突破了狭义的固定化酶的定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、硝酸纤维等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全、稳定和体内易代谢等特点。,是一种与x染色体连锁的遗传代谢病患者由于先天性缺乏HGPRT，导致体内次黄嘌呤和鸟嘌呤补救途径的障碍，并进而引起肾结石、痛风。,Lesch-Nyhan综合症,Chang等人利用微囊型嘌呤氧化酶治疗Lesch-Nyhan综合症，使次黄嘌呤的水平显著下降，同时发现次黄嘌呤能很快地进入微囊体中并被代谢。在以两岁半大的病孩所做的临床试验中，他们也发现效果很好。,药物控释载体：,新的药物（包括化学合成药、天然药物及基因工程药物）不断问世，但将它们应用于临床却并不很顺利：很多药物尤其是蛋白质类药物，口服易被胃酸破坏或沉淀；单纯注射后瞬时血药浓度升高，但马上被肝脏及血液中的酶系统所清除，需要反复注射，不仅增加治疗费用，而且增加了感染的机会；肿瘤化疗用细胞毒性物质选择性较差，全身毒副作用严重；有些药物如反义核酸亲水性强难于穿过细胞膜；蛋白质类药物容易引起免疫反应；很多药物稳定性差，不耐贮存。,以上问题往往不能用简单的药物改构来完成，因此，为药剂学工作者提出了严峻的任务。近30年来，药物的新剂型发展很快，已逐步建立了基于药物理化性质及作用特点的合理给药体系，其核心特点是从时间和空间分布上控制药物的释放。,在肿瘤的化学治疗及重组蛋白质类药物制剂中比较重要的几种控释体系有聚合物修饰、凝胶包埋、微球、脂质体及免疫导向等。这几种控释体系都涉及到将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，因此也可称为载体药物,聚合物修饰,多用于蛋白质类药物。这类药物生物半衰期短、免疫原性强，可用适当的水溶性高分子聚合物加以修饰以改善其性能。羧甲基壳聚糖对天门冬酰胺酶的修饰,聚乙二醇对原核表达重组人血小板生成素分子的修饰等，均可起到降低毒性、延长半衰期的作用。此外，小分子药物也可使用这一系统，如将抗癌药，羟基硫胺素及氨甲蝶呤偶联于羧甲基纤维素后注射，可使荷瘤小鼠平均生存时间较对照组延长2倍左右。,凝胶包埋,即用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制成含有药物的凝胶，植入体内特定部位，以达到缓释给药的效果。药物从凝胶中释出后，经周围组织吸收，然后进入血液循环或直接局部作用，避开了首过效应，生物利用度高，作用时间长。,微球制剂,用高聚物微球包埋或化学偶联药物可制成微球制剂，它具有：靶向性、缓释性及减少抗药性等特点。微球与靶细胞接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用，不影响细胞膜通透性，不会产生抗药性。,早期使用的微球制剂为不被生物降解的，多为口服制剂。现在用于注射的多为可生物降解小于1m的微球，如以生物可降解微球包埋入生长激素肌注动物，血药浓度稳定、不产生抗体，注射部位组织无病变。微球还可用于基因治疗及基因疫苗的载体。,脂质体,-磷脂双分子层在水溶液中，自发形成的超微型中空小泡。,现查明是因缺乏氨基己糖酶A，使神经节苷脂累积在组织内，从而出现神经迟钝、肌肉无力、失聪、视网膜有樱桃红点等症状.,黑蒙性痴呆(Tay-Sach病),Weisman等用被覆抗体的脂质体（内含氨基己糖酶A）引入到4例黑蒙性痴呆患者细胞中，此时细胞不会把含酶的脂质体当作异物。故能通过细胞膜进入细胞内，在细胞内发挥酶的作用。,此外，还有人利用嵌入从胎盘中提纯的葡萄糖脑苷酯酶的脂质体来治疗Gaucher病，发现也能获得较好的疗效。,缺点:单纯脂质体也还是依靠被动靶向性，因而限制了其在肿瘤化疗中的应用；脂质体在胃肠道转运、分布不稳定，缺乏对血管的通透性。等等,导向药物,导向药物具有主动靶向性，将针对肿瘤细胞的单克隆抗体与化疗药物化学交联，可以直接作用于肿瘤细胞产生杀伤作用，并且降低全身毒性。,半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图