DNA的粗提取与鉴定PCR蛋白质的提取与分离课件

DNA的粗提取与鉴定,一、实验原理,1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。,2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。DNA在物质的量浓度为0.14molL的氯化钠溶液中的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。,3.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,1,学习交流PPT,二、方法与过程,1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）,500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心、分离或静置沉淀。,2.提取DNA。,取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌。,纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。,原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌，机械加速血细胞破裂。,.提取血细胞核物质：,.溶解核内的DNA：,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌。,2,学习交流PPT,.析出含DNA的粘稠物：,.滤取含DNA的粘稠物：,.DNA粘稠物的再溶解：,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。,用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。,在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,.过滤含有DNA的NaCl溶液：,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤所得的溶液，滤液中含有DNA。,3,学习交流PPT,.提取含有杂质较少的DNA：,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,3.DNA的鉴定：,加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。,1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”,2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”,三、实验小结,4,学习交流PPT,四、实验原理拓展介绍。,1.DNA的释放。,DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。,2.DNA与蛋白质分离。,在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中,3.DNA的析出与获取。,因为DNA在低浓度（0.14mol/L）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。,5,学习交流PPT,4.DNA的再溶解。,用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。,5.DNA的沉淀和浓缩。,对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na的DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。,6.DNA的鉴定。,鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。,6,学习交流PPT,7,学习交流PPT,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,提取DNA,A出现蓝色B无变化,8,学习交流PPT,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2molL和0.14molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答：B,答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,9,学习交流PPT,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成()A.砖红色B.橘黄色C.紫色D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答：D,10,学习交流PPT,(一)PCR原理,体内DNA复制:模板DNA原料:dNTP酶:解旋酶、DNApol.起始引物、合成方向合成环境,11,学习交流PPT,解链模板变性引物-起始引物-模板复性子链延伸子链延伸,(一)PCR原理,12,学习交流PPT,结果分析与评价,此为紫外光吸收检测的结果检验法，实践中很少用；普遍采用琼脂糖凝胶电泳法检验PCR结果,13,学习交流PPT,Fig.7.23,DenatureAnnealPCRPrimersExtendPCRPrimersw/TaqRepeat,14,学习交流PPT,多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段,15,学习交流PPT,一、实验目的,了解PCR的基本原理，学习PCR的基本操作技术。,16,学习交流PPT,二、实验原理,多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板53端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个模板DNA分子经20次循环扩增后可达106。,17,学习交流PPT,PCR的基本原理,变性、复性、半保留复制,一生二，二生四，四生万物,PCR三步曲,变性9097,退火4565,延伸72左右,PCR过程,18,学习交流PPT,(二)PCR的反应过程,变性-复性-延伸多重循环(n)模板以2En扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间,19,学习交流PPT,PCR技术广泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及医学鉴定等多方面，也被广泛运用于刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子系统学研究等其他领域。,20,学习交流PPT,高中生物技术实践课件,血红蛋白的提取和分离,21,学习交流PPT,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝胶色谱法电泳法缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：样品的预处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,22,学习交流PPT,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代,人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,23,学习交流PPT,2.提问：血液有哪些成分？,1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,24,学习交流PPT,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,25,学习交流PPT,1.分离生物大分子的基本思路：,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、血红蛋白的提取和分离,3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：,使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。,26,学习交流PPT,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,1.概念：,3.凝胶色谱法的原理分子筛效应：,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,27,学习交流PPT,4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,28,学习交流PPT,（二）缓冲溶液,1.概念:,在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,2.作用:,3.缓冲溶液的配制:,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性),磷酸缓冲液,29,学习交流PPT,缓冲溶液的组成及分类,弱酸及其对应的盐：,弱碱及其对应的盐：,多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:,H2CO3NaHCO3；CH3COOHCH3COONa,NH3H2ONH4CL;NH4OHNH4CL,NaHCO3Na2CO3；NaH2PO4Na2HPO4,缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸；能对抗外来强酸的称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下三种类型：,30,学习交流PPT,（三）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,31,学习交流PPT,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,32,学习交流PPT,聚丙稀酰胺凝胶电泳,1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,33,学习交流PPT,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。,2.原理：,聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3.SDS作用机理:,34,学习交流PPT,用SDS测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,35,学习交流PPT,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.样品处理：,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。,洗涤操作：,1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。,36,学习交流PPT,(2)血红蛋白的释放：,加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,二、实验操作,37,学习交流PPT,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,38,学习交流PPT,(4)透析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,二、实验操作,39,学习交流PPT,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,40,学习交流PPT,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,41,学习交流PPT,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,（2）凝胶色谱柱的装填,50cm高,42,学习交流PPT,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,43,学习交流PPT,（3）样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,44,学习交流PPT,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,45,学习交流PPT,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（SDS）:用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制10%过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。Tris甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。样品处理液：50mmol/LTrisHCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。染色液：0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。,46,学习交流PPT,1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。,注意事项：,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,47,学习交流PPT,SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备：,3、电泳方法步骤,48,学习交流PPT,（3）样品处理：在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100温度下加热3min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为1025L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即