基本微生物学.ppt

第二章微生物的觀察與檢驗,顯微鏡構造及使用微生物染色微生物鑑定,第一節顯微鏡構造及使用,顯微鏡的種類與功能顯微鏡若依觀察方法的差異性，則可區分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、位相差顯微鏡、干擾相差顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外光顯微鏡、螢光顯微鏡、雷射共軛焦顯微鏡、解剖顯微鏡與電子顯微鏡等特定功能之顯微鏡。,光學顯微鏡原理光學顯微鏡是由二組凸透鏡（物鏡、目鏡）組成。欲觀察的物體先經物鏡聚成一放大的倒立實像，該倒立實像於顯微鏡成像過程中僅屬於過渡性的影像，此倒立實像恰巧落於目鏡的焦點內，所以當人眼緊靠目鏡的出視孔時，可觀察到倒立實像經目鏡放大後的更加放大之倒立虛像。,放大率顯微鏡的放大功能原理是將物鏡和目鏡做適當地調整組合，以放大欲觀察物體（標本）之影像。物鏡的功能為使被觀察物體成一個倒立放大的實像。低倍鏡常用於搜索觀察對象及觀察標本全貌，高倍鏡則用於觀察標本某部分或較細微的結構，油鏡則常用於觀察微生物或動植物更細微的結構。目鏡的功能則是將物鏡形成的實像再一次放大成虛像。顯微鏡總放大率物鏡之放大倍數目鏡之放大倍數。,解像力解像力是指鏡頭能清楚分辨二相近物體間最小距離的能力。若鏡頭中有二個物體接近到幾乎重疊時，此時通過物體的光線會產生繞射，進而在物體周圍產生一系列光圈，使得二物體無法被清楚辨識，此即表示鏡頭對該二物體已失去解像力。,顯微鏡解像力可由下列數學公式表示：,式中D值愈小，表示顯微鏡的解像力愈好，亦即物體可視的二點最短距離很小時仍可以被辨識。由式(1)可知，顯微鏡解像力與入射光波長、光入射角、介質的折射率有關。入射光光源波長：值愈大，D值愈大；值愈小，D值愈小，亦即入射光波長愈長，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；入射光波長愈短，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。,光入射角：sin值愈小，D值愈大；sin值愈大，D值愈小，亦即光入射角愈小，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；光入射角愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。顯微鏡解像力有實質幫助的光入射角度最大值僅為140。,介質的折射率：n值愈小，D值愈大；n值愈大，D值愈小，亦即標本與物鏡間介質的折射率愈小，顯微鏡辨識物體之解像力愈差；標本與物鏡間介質的折射率愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。數值孔徑(numericalaperture)：亦稱光口徑，是表示經由聚光鏡至物鏡所產生錐狀光圈的量度。,電子顯微鏡電子顯微鏡與光學顯微鏡的原理極為相似，差異在於電子顯微鏡以電子束取代光線，電磁鐵透鏡取代玻璃透鏡，由於電子輻射的波長比可見光小很多，故大幅提昇解像力（普通光學顯微的最小解像距離為0.2m，電子顯微鏡可達到0.001m，亦即10）。,光學顯微鏡,明視野顯微鏡暗視野顯微鏡位相差顯微鏡螢光顯微鏡,光學顯微鏡明視野顯微鏡明視野顯微鏡是以自然光或鎢絲燈（電燈）為光源照射樣本，通過與未通過樣本之光線皆進入物鏡中，使得樣本本身呈陰暗，視野背景為明亮狀態。暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡與明視野顯微鏡相似，皆利用可見光為光源照射樣本，唯一差異在於暗視野顯微鏡的聚光鏡中央有暗視環，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被樣本散射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景為陰暗，物體的邊緣為明亮。,位相差顯微鏡位相差顯微鏡利用菌體內各部位密度的差異，進而對入射光線產生不同的散射，使得活細胞內不同部位產生明顯對比，藉此辨別活細胞內各種構造。位相差顯微鏡較普通光學顯微鏡多了環狀光圈與位相板（位相移動片）等構造。螢光顯微鏡螢光顯微鏡是藉由樣本發出的光來達到觀察之目的。某些物質經激發光照射後會產生螢光，無法產生螢光的物質亦可利用螢光染劑與欲觀察的物質結合後產生。螢光顯微鏡包含光源、激發濾光片、螢光樣本與阻斷濾光片等基本元件。,電子顯微鏡掃描式電子顯微鏡穿透式電子顯微鏡,掃描式電子顯微鏡掃描式電子顯微鏡主要用於用來觀察樣本的表面結構。以掃描式電子顯微鏡觀察微生物菌相時須經過煩瑣之前處理過程，其過程包括菌體收集、樣本（菌體）固定、樣本脫水、臨界乾燥、鑲嵌及鍍金。穿透式電子顯微鏡穿透式電子顯微鏡多應用於細胞內結構之觀察。穿透式電子顯微鏡樣本製備包括樣本初步固定、樣本清洗、二次固定、脫水、過渡溶劑滲透、塑膠滲透、包埋及聚合。,電子顯微鏡,放線菌的孢子鏈,第二節微生物染色,染色目的染色原理染劑染色方法(1)簡單染色(2)鑑別染色,革蘭氏染色(Gramstain),結核桿菌與抗酸性染色,結核桿菌不會馬上致命，但具有高度傳染力的病患透過飛沫傳染，擴散率相當高，快速檢驗患者並與以隔離是相當重要的。結核病大都是結核桿菌引起的，由於結核桿菌細胞膜上的脂質比其他細菌豐富，經染色後不易被酸性的酒精洗除脂質而退色，故名抗酸性染色。因此抗酸性染色為初步辨識結合桿菌的方法之一。,何謂酸性酒精？含有3%鹽酸及9095%乙醇。,微生物檢驗,顯微鏡觀察測定影響微生物生長因子(1)物理因子(2)化學因子a.能源b.碳源c.氮源,第三節微生物檢驗方法,微生物的定性觀察微生物大小的量測總菌數測定大腸菌類數目,微生物大小的量測,鏡臺測微計,總菌數測定,直接計數法(cells/ml，filam