细胞培养标准操作程序(SOP)

细胞培养标准操作程序(SOP )1 .目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确准确地执行细胞培养的基本操作步骤，制定实验室细胞培养的操作步骤。2 .适用范围：适合来我院细胞室进行细胞培养的人。3 .操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的制备3.1.1 1000ml培养液的制备1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻璃棒、量筒、电子分析天平、PH计、23天新鲜三蒸馏水(或新鲜反透水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、23个过滤器、注射器。 紫外线照射台为30min。2 .用新鲜的三蒸馏水900ml (或新鲜的反透水)溶解培养粉，冲洗袋内的残留粉末。3、充分搅拌，按照说明添加成分(例如，在Invitrogen公司的RPMI-1640制备中添加NaHCO3粉2.0g、在Invitrogen公司的DMEM中添加NaHCO3粉3.7g等)，充分搅拌。 不需要谷氨酰胺。 因为它包含在培养基中。用4，1 m (1mol/l ) HCl将PH调整到7.0左右(细胞在PH7.27.4下生长，调制后PH上升0.20.3，调制时将PH调整到7.0左右)。用新鲜的三蒸馏水(或新鲜的反透水)定容在1000ml。6、用青霉素80万/瓶4ml蒸馏水溶解配合链霉素100万/瓶4ml蒸馏水溶解向1000ml培养液中加入青霉素0.5ml和链霉素0.4ml，充分搅拌混合，使最终浓度达到100U/ml。7 .在无菌操作台，将配制的培养液用0.22um的除菌过滤器过滤，分装在100ml玻璃瓶中。 玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡胶塞，在-20保存。注意：(1)用于培养液的制备及培养液的PH调节的HCl和(或) NaOH需要新鲜的三蒸水(或新鲜的反透水)的制备。一般在配制当天配制，保证水的纯度和质量。(2)准备的100ml10个玻璃瓶必须预先进行高压灭菌！ 烧杯、量筒、玻璃棒、新鲜三蒸馏水(或新鲜反渗透)水)的容器不必全部高压灭菌，只要清洁即可。3.1.2PBS (平衡盐溶液)的制备NaCl8g战斗机KCl0.2g新鲜三蒸馏水(或新鲜反透水) 1000mlNa2HPO4*H2O1.56gKH2PO40.2g(1)无需调整ph值，成分溶解后的ph值为7.4，不需要除菌过滤器的过滤除菌，在4下保存，使用前直接在高压下除菌(高压时，PBS瓶的盖需要销！ 中所述情节，对概念设计中的量体体积进行分析(2)Na2HPO4*H2O1.56g的话，Na2HPO4*12 H2O需要3.4888g(要调制500ml，以上成分减半即可3.1.30.25%胰蛋白酶的制备胰蛋白酶粉2.5gEDTA (乙二胺四乙酸二钠) 0.3gNaCl 8.0g从KCl 0.4g 新鲜三蒸水(或新鲜反透水) 1000MLNaHCO3 0.5g葡萄糖1.0g苯酚红0.06g克(1)配合的PH为7.6，PH为7.67.8的范围，因此无需调整PH。(用0.22um的除菌过滤器分注，瓶口用薄膜封口，在-20下保存。 4下可连续使用1个月左右。(3)分注用玻璃瓶须事先进行高压灭菌！ 放烧杯、量筒、玻璃棒、新鲜三蒸馏水(或新鲜反透水)的容器无需高压灭菌，清洁即可。(要调制500ml，以上成分减半即可3.2细胞复苏1、准备：紫外线照射台30min，高压灭菌吸管，装有试管的便当盒，准备废液罐的培养基在使用前放入水浴盒加热20分钟。 在操作台上放置物品，左边是便当盒，培养液等，中间是酒精灯，试管架等，右边是吸管架，镊子，右边是废液罐。2、将瓶口和瓶盖烧灼培养，用滴管取出培养基5ml放入试管(一滴约50ul )。3、戴手套，从-196液氮浴中取出冷冻保管管，立即放入37水浴箱中快速解冻，同时轻轻摇动冷冻保管管，保证冷冻保管管内的细胞在1min以内溶解。 用70%的酒精擦拭保存管的外部，转移到无菌操作台。 (慢慢冷冻就会融化)4 .用吸取细胞液的滴管从冷冻保存管中完全吸取细胞悬浊液，放入加有培养基的试管中，塞住试管，以800rpm离心2min (以培养基离心的目的：除去细胞冷冻保护剂DMSO，常温下对细胞的毒性大)，因此舍弃上清液，试管底部的白色物质为细胞，轻拂在试管中加入培养基、FBS (胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS浓度达到20% )。 用吸收细胞液的滴管轻轻吹，混合细胞，凝固在培养瓶中，不影响细胞的成长。用吸液管吸取试管的细胞悬浊液，全部放入培养瓶，显示日期、细胞名称，将培养瓶放入CO2培养箱。 (注意：放入培养瓶后，培养瓶轻轻平整，用手拿着培养瓶的侧壁，左右上下轻轻摇动数次，使细胞均匀地贴在培养瓶的底部。 中所述情节，对概念设计中的量体体积进行分析6 .收拾要使用的物品，用75%的酒精喷洒工作台，擦拭桌子，保持桌子清洁。注意：(1)进入细胞室前观察CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力在0.1mPa以上(2)刚复苏的细胞需要更多的营养成分，使FBS浓度达到20%。(3)离心时间为12min，速度为800转，不要太离心，不要对细胞造成大的损伤。(4)吸管使用注意事项：a .吸收细胞液专用滴管，各株细胞滴管必须严格分离。 不能混用来防止细胞间的污染。b培养基和FBS (胎牛血清)可以用吸管，但是分开使用比较好！c.FBS (胎牛血清)与胰酶不同，血清具有抑制胰酶活性的作用。d .胰酶和PBS (平衡盐溶液)可以使用吸管，但最好分离(5)并非所有细胞都能复苏生存。 死亡原因：冷冻保存时间过长(如2年以上)，技术不相关(如吹打剧烈)，细胞遗传代数过多等。(6)关于PBS (平衡盐溶液) :a .调配PBS溶液后，如果必须进行高压灭菌的PBS为高压，栓子必须要有销头。b. PBS和培养基能冲洗培养瓶中细胞中的杂质，但需要用高温PBS冲洗细胞中的杂质。 PBS虽然冲洗杂质的效果很好，但是因为有容易脱壁的倾向，所以不能经常冲洗细胞。c .温度低的PBS在消化难以消化的细胞之前做好清洗准备，在细胞中加入胰酶使其易于消化。d .消化后，暂时不培养细胞的培养瓶中加入23 ml PBS (防止培养瓶干燥)，培养瓶可以放入CO2培育箱中短时间保存。 下次用该培养瓶再培养同种细胞时，吸入PBS后丢弃，用培养基洗一次后可以再利用。(7)DMSO (二甲亚砜)在常温下对细胞毒性大，但在4下毒性大幅度减弱，冷冻保存的细胞复苏后，必须立即清洗冷冻保护剂DMSO (离心丢弃上清)，防止DMSO在常温下对细胞产生大的毒性3.3细胞交换液1 .用倒立显微镜观察细胞生长状态：a .移动细胞培养瓶，观察到浮游状态的细胞是死细胞b .生长状态良好的细胞：透明度大，折射性强，可见部分轮廓不清的细胞微结构，在细胞对数生长期间可见许多分裂期细胞。c .生长状态差的细胞：细胞折射性减弱，轮廓增强，细胞质常出现空泡、脂滴、颗粒状物质，细胞间空隙增大，细胞变得不规则，失去了原有特征。d .只有生长状态良好的细胞适合传代和实验。2、紫外线照射台为30min，准备吸管、试管饭盒，加热培养基，不加热FBS (胎牛血清)。 实验开始时开启照明和吸引风扇，用75%的酒精喷射双手。 点燃酒精灯放在中间。 滴定管放在滴定管的架子上，从左到右依次是吸收细胞液的滴定管、吸收培养基的滴定管、吸收FBS (胎牛血清)的滴定管。 从水浴箱中取出培养基，擦干水后放入工作台左侧。3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，用酒精灯的外焰旋转瓶口、盖子烤(注意不要把盖子烧焦)，用吸管(前端的90%部分)烤。 细胞培养瓶倾斜，用吸收细胞液的吸管吸收旧液放入废液滤杯中，尽可能干净地吸收。 注意：滴管的胶头在瓶子外部按压，放入培养瓶中，避免产生气泡，避免过度放入瓶中，防止污染滴管的前端浮起，不要接触废液滤杯(用眼睛看废液，滴管的前端不要接触废液滤杯)4、用吸取培养基的吸管吸取培养基，将90滴放入培养瓶(25c)，用吸取FBS (胎牛血清)的吸管吸取FBS 10滴放入培养瓶。 (使FBS浓度为10% )5 .关闭细胞培养盖后，旋转半圈，使空气流通良好。 让CO2孵育器睡觉。6 .收拾要使用的物品，用75%的酒精喷洒工作台，擦拭桌子，保持桌子清洁。注意事项：(1)培养基、FBS (胎牛血清)、打开培养瓶前后旋转烧灼瓶口和瓶盖，细心注意无菌操作。 灭菌饭盒只能在无菌操作台打开。(2)镊子每次使用前必须先烤好。 装有FBS的瓶盖很小，用镊子夹住瓶盖烤后，拆卸夹住瓶盖的瓶盖时，也用镊子夹住瓶盖拆卸。(3)滴管在初次使用前也需要烧灼。 注意：除了吸取细胞液的滴定管外，其他滴定管滴下液体时，必须在空中滴下。 吸入液体的滴管在再次使用之前不能烧掉！ 不要搅拌滴管！(4)培养瓶口，使其不对着自己，不加试剂时请把瓶口弄平。(5)培养液最好没有细胞。(6)细胞液颜色变黄，死亡细胞多时换液。 不要求每天换液，污染的机会容易增加。3.4细胞数1、原理：(1)用计算细胞数的血细胞计数盘计数。(2)血细胞计数盘通常有2个chamber，每个chamber刻9个1mm2的大正方形，其中四角正方形再刻16个小格子，深度均为0.1mm。 在chamber上复盖盖玻璃时，各大正方形的体积为1mm20.1mm=1.0x10-4ml。 使用时，数一个大正方形内的细胞数，乘以稀释倍数，再乘以104，即可得到每ml的细胞数。细胞数/ml=4大格细胞总数/4104注意：镜下偶然见到两个以上细胞组成的细胞块，必须用一个细胞计算。 如果细胞块占10%以上，就有必要说明分散不良，重新制作细胞悬浊液。2、计数方法：(1)用1) 75%酒精棉棒清洗盖玻片和计数板，用干纱布或棉棒再次擦拭，放置盖玻片。(2)用滴管从喷洒的细胞悬浊液中取出滴液，用样品枪喷洒滴液，从中吸取13ul到玻璃罩的边缘(注意不要溢出，注意不要有气泡)。(3)观察计数：压线的左边不记得右边，不记得右边的组织细胞只记得一个，首先用低倍镜(红，4 )找到大的位置，用中倍镜(黄，10 )计数。细胞数/ml=4大格细胞总数/4104(4)计数结束后用75%酒精棉棒擦拭玻璃罩和计数板，再用干纱布(或干棉棒)擦拭一次。3.5细胞传代1、紫外线照射台为30min，准备细胞培养所需要的物质。取1根灭菌试管，配合完全培养基(培养基：FBS=54滴： 6滴)。3 .用吸收细胞液的吸管吸收旧液体。4、胰酶消化：将约1ml(20滴)胰酶放入培养瓶消化。 胰酶最好把瓶底培养平。 倒立显微镜观察培养瓶内的细胞，大量的细胞质收缩，细胞间隙增大，但不脱离培养瓶底部，立即用吸引细胞液的吸管吸引胰酶废弃，将细胞培养瓶放入CO2培养箱继续消化残留胰酶(37时胰酶消化效果最好)。每5、1min用倒置显微镜观察培养瓶，观察到细胞变圆、透明、细胞间隙明显增大时，用吸收细胞液的吸管从试管中吸收预制的完全培养基3ml，放入培养瓶中停止消化。6、用吸收细胞液的吸管温柔地吹，保证吹到培养瓶底的各个角落，斜面不容忽视(可以把吸管吹到瓶口处)。 吹风时不要产生气泡。 因为对细胞有损伤。温柔地吹，强烈地吹也对细胞有损伤。 新学者在角落里包括斜面吹5次，也吹到靠近瓶口端的角落里，用吸收细胞液滴管将培养瓶的所有细胞悬浊液转移到试管里，用滴管可以混合细胞悬浊液。7、取一滴细胞悬浮液计数(此步骤为积累培养细胞的经验，观察多少密度细胞具体需要几天，有经验可以省略此步骤。 如果还需要铺路，请务必计数！ 中所述情节，对概念设计中的量体体积进行分析8、传代：根据细胞的数量、成长的速度、难易度等，一般以1:5的比例传代。 首先用滴定管喷洒3ml(60滴)细胞悬浮液，将12滴细胞悬浮液取入培养瓶，补充完全培养基(培养基：FBS=9:1 )，使液体的总体积为4ml，放入CO2培养箱中继续培养。9 .收拾要使用的物品，用75%的酒精喷洒工作台，擦拭桌子，保持桌子清洁。注意：(1)难消化的细胞(例如Bxpc-3胰腺癌细胞)在用胰酶消化之前，首先用12ml (即2040滴，或者12滴)的4PBS洗涤，易消化的细胞不需要该步骤。(2)必须防止细胞过度消化！ 由于过度消化，细胞凝固，变得不均匀，对细胞造成很大的损伤，使细胞壁张紧，使生长状态恶化。*过消化特性：a .不加入完全培养基在消化停止前成熟的细胞从培养瓶的壁上脱落，胰酶中出现很多浮游物，为了下落的细胞。b培养瓶底板本身白色，消化后细胞脱壁，发现培养瓶底板有缝隙。(3)过消化处理：不吸入胰酶，立即加入完全培养基3ml，消化结束后，集中收集到试管中，以800 rpm离心3min，丢弃上清(失活的胰酶、培养基、FBS )。 细胞沉淀(白色沉淀物)在试管底部，用手指轻击细胞进行分解，重新放入适量的完全培养基，混合后放入培养瓶继续培养。(4)在37的温度下加入未培养的胰酶(仅指室温)消化细胞时，即使细胞变圆、透明，在完全的培养基中止消化后，也很难敲打。 因为胰酶的温度不适当，所以应该将残留有胰酶作用的培养瓶放入CO2培养箱中，放置5min，使胰酶在最佳温度(37)下消化细胞。(5)试管的细胞悬浮液转移到培养瓶中时，滴管每次在试管中取液，为了防止细胞不均匀，温柔地喷射液体，影响培养瓶的生长。(6)不管强烈吹风还是产生气泡，都会对细胞造成损伤，所以请尽量减少温柔吹风时气泡的产生。(7)吹气结束后，最好尽量将细胞分离成单一细胞。(8)完全培养基是含有10 % FBS (胎牛血清)的培养液(基)。(9)犊牛血清使用