外周血DNA的提取PPT课件

外周血中DNA的提取与鉴定,.,实验目的,掌握人全血DNA提取的原理和操作步骤。了解DNA基本理化性质。3.初步了解DNA琼脂糖电泳鉴定的方法。,.,实验原理,1保证DNA一级结构的完整性；2其他生物分子如蛋白质、多糖和脂类等分子的污染应尽量降低到最低；3尽量去除对后续分子实验有抑制作用的有机溶剂和重金属离子；4其他核酸分子RNA，应根据实际需要处理。,DNA提取总的原则,.,实验原理,理论上所有真核细胞、原核细胞、病毒等都可以提取DNA。样本选择取决于实验目的。全血是基因组提取中最常见的样本之一。,样本来源,.,理化性质,核酸是由碱基、戊糖及磷酸组成的生物大分子，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两类。1.酸碱性核酸分子中有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基，属于两性化合物，但是磷酸基的酸性较强，所以核酸总体上表现为酸性，带负电荷。2.溶解度与粘度核酸是极性化合物，微溶于水，其钠易盐溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有机溶剂。核酸是高分子化合物，粘度很大。3.紫外吸收核酸有强烈的紫外吸收，其最大吸收峰在260nm处，常以A260表示。,.,实验原理,生物的大部分或几乎全部的DNA都集中在细胞核或核质体中，人与动物的DNA主要存在于细胞核中，并与蛋白质结合的构成大小不一的染色体。所以蛋白质是DNA提取过程中常见的污染之一，而且蛋白质污染常常影响到以后的DNA操作过程，因此提取过程中要把蛋白质去除。,.,实验原理,本实验中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法。基本原理就是苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA却没有影响。经苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相与水相完全分层，蛋白质变性而被离心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于酚/氯仿相，从而与水相分离得以去除。,.,实验原理,此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质，但是RNA极易降解。而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响，如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。,.,实验步骤,1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL,按照1:51:10的比例加入去离子水裂解8min，然后1700rpm/min离心，去掉含有红细胞碎片的上清液，重复裂解一次，留取白细胞沉淀。,.,实验步骤,DNA细胞裂解液(pH8.0)：150mmol/LNaCl、10mmol/LTris-HCl、10mmol/LEDTA、0.5%SDSDNA细胞裂解液中SDS的是表面活性剂，主要作用裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面。另外，Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相，减少在蛋白质层的滞留。,2.加入0.5mL的DNA细胞裂解液来悬浮白细胞沉淀。,.,实验步骤,3.悬浮后的溶液中添加蛋白酶K20L，65水浴0.5h，期间轻缓地倒转几次。,4.室温下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液，剧烈地震荡混合10min，然后8000rpm/min离心10分钟，然后将水相移至新的离心管中。,细胞膜裂解以后，细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中，而蛋白酶K具有水解蛋白质和DNA酶的作用，并且在EDTA和SDS存在的条件下仍保持较高的活性。,在苯酚/氯仿加入少量的异戊醇，可以减少实验中气泡的产生，而且有利于分层，保持分层的稳定性。,.,实验步骤,5.添加1mL的预冷的无水乙醇到水相中，混匀，8000rpm/min离心3分钟。,加入无水乙醇可以吸收水相中的水分，使得DNA沉淀析出。,6.沉淀用70%的预冷乙醇洗涤两次，然后干燥，最后用50L去离子水悬浮。,70%的冰乙醇可以去除可溶性的多糖、金属离子等杂质以及残留的苯酚/氯仿等。,.,实验步骤,7.用1%的琼脂糖电泳鉴定所提取的DNA。,8.剩余的DNA贮存在4冰箱中,备用。,.,注意事项,一.提取染色体DNA最根本的要求就是保持核酸的完整性。所以操作过程中要注意：1物理因素高分子量的DNA长而弯曲，仅有极微的侧向稳定性，机械张力和高温很容易使DNA分子发生断裂。因此，实际操作过程中尽量轻缓，尽量避免过度的溶液吹打转移，以及过高的温度。2化学因素在过酸的条件下，由于DNA脱嘌呤而导致DNA的不稳定，容易在碱基脱落的地方发生断裂。因此避免使用过酸的条件。二.步骤3转移水相时