第九章模拟酶人工酶-课件.ppt

1,第九章模拟酶与人工酶,2,模拟酶的理论基础和策略,模拟酶的概念吸收酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。由此可见，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特异性的一门科学。一方面基于酶的作用机制，另一方面基于对简化的人工体系中识别、结合和催化。,较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠醚、环番、环芳烃、卟啉等大环化合物；大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型、胶束酶模型。化学修饰、基因工程改造天然酶产生的半合成人工酶。抗体酶,理论基础,主客体化学：主体和客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域。本质上，来源于酶和底物的相互作用，主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。超分子化学：超分子起源于底物和受体的结合，基于非共价健的相互作用，如静电作用、氢键、范德华力等。当接受体和络合离子或分子结合成稳定的、具有稳定结构和性质的实体，即“超分子”，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。主客体化学、超分子化学是酶人工模拟的重要理论基础。根据酶催化反应机理，若能合成出能识别底物又具有酶活性部位催化基团的主体分子，就能有效地模拟酶的催化过程。,5,设计模拟酶前，酶的结构和酶学性质的深入了解：（1）酶活性中心-底物复合物的结构、（2）酶的专一性及其桶底物结合的方式和能力、（3）反应的动力学及各中间物的知识。,设计要点,6,设计人工酶模型应该考虑的因素：（1）非共价键相互作用是生物酶柔韧性可变性和专一性的基础，故酶模型要为底物提供良好的微环境；（2）催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近，以促进反应定向发生；（3）模型应该具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。,设计要点,7,模拟酶可分为：根据Kirby分类法（1）单纯酶模型：即以化学方法通过天然酶的活性模拟来重建和改造酶的活性。（2）机理酶模型：即通过对酶作用机制诸如识别，结合和过渡态稳定化的认识来指导酶模型的设计和合成。（3）单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子,按照模拟酶的属性，可分为：主客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹半合成酶。,9,模拟酶的介绍,一.主、客体酶的模型天然宿主：CD合成主体：冠醚、穴醚、杂环大分子化合物、卟啉类,10,主、客体酶的模型,（一）环糊精酶模型环糊精是环状低聚糖的总称。其中研究得最多的是环糊精。环糊精是由6个葡萄糖分子按照14连接方式形成的一种环状结构天然淀粉，并具有园柱型立体结构特点。,11,2环糊精结构示意,外侧亲水，OH可与多种客体形成氢键。内侧C3C5的H和糖苷O组成的空腔，疏水性，能包结多种客体分子，类似酶对底物的识别。,12,介绍几种水解酶模型1.水解酶模型-胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，具有疏水性的环状结合部位，能有效的结合芳环。催化部位有57号组氨酸咪唑基，102号天冬氨酸羧基及195号丝氨酸羟基。,13,水解酶模型,A:-Benzyme,水解叔丁基苯基乙酸酯（p-NPAc）比天然酶快1倍。B：咪唑直接与CD连接，比天然酶催化速度快1个数量级。C：增加CD对底物过渡态的结合能力：修饰底物增加，底物与CD的结合，如用二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基苯酯,CD作为催化剂加速水解大105-106倍。,14,2.核糖核酸酶模型核糖核酸酶具有2个组氨酸咪唑基及1个质子化赖氨酸基处于活性中心。在它的催化下RNA的磷酸酯水解分为两步进行，两个咪唑基交替起到一般酸或碱的催化作用，使离去基团质子化或增加亲核基团的亲核性。,Breslow等人设计了2种核糖核酸酶模型：A、B，A催化只生成III，B催化只生成II。CD底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置对选择性起了决定性作用。最佳pH6：一个咪唑基以碱的形式，另一个咪唑基以质子化形式参加反应，与天然酶相似。,16,3.转氨酶的模型：,磷酸吡哆醛（胺）是转氨酶的辅酶，最重要的反应是酮酸与氨基酸的转换，转氨反应机理.没有酶存在时，磷酸吡哆醛（胺）也能实现转氨作用，但反应极慢，其无任何选择性。原因在于辅酶本身无结合部位，不能形成酶-底物络合物，后者是酶反应必不可少的环节。,第一个模拟转氨酶模型1980年被报道，磷酸吡哆胺连在-CD上，模拟酶的转氨反应比磷酸吡哆胺单独存在是快200倍，CD空腔能稳定结合类似亚胺中间体的过渡态。最大特点：良好的立体选择性，-CD的手征性，产物氨基酸也具有光学活性。,17,18,Han等人合成了含核糖的CD酶模型，兼具核酸酶、连接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活力。核糖中相邻的二个羟基是关键，水解环状磷酸酯的速率提高33倍。,19,CD分子研究热点,CD和底物的结合常数104L/mol,酶，过去的工作：CD的修饰，在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能，通常只有单包结部位和双重识别作用。现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用，结合常数108L/mol,20,将乙二胺与CD偶联，然后与Cu盐作用形成桥连环糊精。,含镍的水杨酚CD复合物A、B，对一些特殊结构的三肽化合物有显著的选择结合能力,用于肽库中筛选特异性小肽。,21,胡萝卜素氧化酶的模拟：含卟啉的桥连CD，金属卟啉能催化双键，可以选择性氧化C15=C15键。合成的复合物对底物胡萝卜素的结合远大于产物视黄醛。,四桥连的CD模拟P-450酶（抗氧化酶，细胞色素），P-450活性中心的金属卟啉分子与4个CD相连，既有底物结合部位又有催化基团的小分子。,22,23,（二）合成的主客体酶模型,合成的冠醚、穴醚、环芳烃作为主体构筑酶模型。日本学者合成了带巯基的仿酶模型，可在分子内实行“准双分子反应”以合成多肽，此模型具有结合两个氨基酸的能力。,24,冠醚水解酶的模拟,含冠醚环和SH基的主体分子A、B、C，分子中的冠醚环为结合部位，含醚侧臂或亚甲基为主体识别部位，侧臂末端为催化部位。,25,二.胶束酶模型,胶束在水溶液中提供了疏水微环境（类似酶的结合部位），可以对底物束缚。如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基、一些辅酶共价或非共价连接或吸附在胶束上，就有可能提供活性中心部位，合成有酶活力或部分酶活力的胶束酶模型。,1.模拟水解酶的胶束酶模型2.辅酶的胶束酶模型3.金属胶束酶模型,26,模拟水解酶的胶束酶模型,表面活性剂分子上连接组氨酸残基或咪唑基团，就有可能形成模拟水解酶的胶束。如：N-十四酰基组氨酸所形成的胶束催化PNPA（对硝基苯酚乙酸酯）的水解，催化效率比N-乙酰基组氨酸(无胶束)高3300倍。如果该胶束中加入带羟基的表面活性剂N，N-二甲基-N-（2-羟乙基）十八烷基氨溴化物，共同催化PNPA的水解，先生成酰基咪唑基中间体，然后酰基转移到羟基上（电荷中继系统），与-胰凝乳蛋白酶水解很相似。,27,辅酶的胶束酶模型,将疏水性VB6长链衍生物与阳离子胶束混合形成泡囊体系中，在Cu2+存在下可将酮酸转化为氨基酸，有效模拟了VB6为辅酶的转氨基作用，氨基酸的收率达52%.阳离子胶束不但能活化催化基团，也能活化辅酶的功能团。,28,金属胶束酶模型,带疏水键的金属配合物单独或与其他表面活性剂共同形成的胶束体系。模拟金属酶的活性中心结构和疏水性的微环境。金属离子-催化水解反应，疏水性微环境-底物包结。模拟羧肽酶A、碱性磷酸酯酶、氧化酶、转氨酶。如：羧肽酶A的模拟,水解PNPP（-吡啶甲酸对硝基苯酚酯）,Cu2+、Zn2+与相应的表面活性剂形成1：1的配合物时，水解反应速度最大。,29,三.肽酶肽酶(pepzyme)就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。四.半合成酶半合成酶是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物的方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。类型1：选择性修饰AA侧链将一种AA侧链化学转化为新的AA侧链（化学诱变法）类型2：将辅酶引入母体结构制备半合成酶，如黄素木瓜蛋白酶，其他辅酶如VB1、吡哆醛、卟啉都可以共价偶联到某些酶的结合部位，产生新的实用催化剂。,30,抗体酶（Abzyme),催化抗体又称抗体酶：是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上，是一类具有催化活性的免疫球蛋白，在其可变的区域赋予了酶的属性。,抗体,由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。抗体的最显著的特征是多样性和专一性,酶是生物催化剂,酶是一类具有催化功能的生物分子酶反应有两个主要的特征：高催化效率、高选择性1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的实质酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。,对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一定的能量，成为活化态或称过渡态。过渡态处于最高能阶上。过渡态与反应物的能阶之差称为活化能。获得活化能的多少与反应的速度成正比。,过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。,过渡态理论,过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。,过渡态理论,与反应过渡状态结合作用,在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物-实际上是底物形成的过渡状态，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。,抗体与酶,抗体具有极高的亲和力，与酶相似。抗体与酶的本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，结合过渡态降低能障，而抗体是和基态紧密结合的物质。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性（抗体酶）。,1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性，在过渡态理论的基础上首先提出设想：能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能具有酶的活性，催化反应的进行。1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。,抗体酶设想,抗体酶的发现,Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。1986年美国Lerner和Schultz两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体，即抗体酶。,1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。,抗体酶,抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalyticantibody)一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。,过渡态理论与抗体酶,如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。实际所采用的过渡态抗原只是推测而设计的过渡态类似物。用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。,抗体酶具有典型的酶反应特性,结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；仍比天然酶慢抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。在理论上研究酶的作用机理，也为过渡态理论提供依据。,抗体酶的特性,有更强的专一性和稳定性抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，活性较高。,抗体酶的催化反应类型,天然酶所催化的6种酶促反应和数10种类型的常规反应的抗体酶，如酯、羧酸和酰胺键的水解、酰胺的形成、光诱导裂解和聚合、酯交换、内酯化、克莱森重排、金属螯合、环氧化、氧化还原、化学上不利的环化、肽键形成、脱羧、过氧化、周环反应。能催化一些天然酶不能催化的反应有许多化学反应还没有已知酶催化进行抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性抗体酶可以根据需要人工裁制,抗体酶的制备,将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。,诱导法,设计半抗原选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；将此抗原进行免疫，使宿主针对抗原产生抗体。用标准的单克隆技术制备、分离、筛选抗体酶：产生抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤细胞既能产生抗体又能在体外培养；将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体。,拷贝法,用已知酶为抗原免疫动物，获得抗酶的抗体，再将这种抗体免疫动物进行单克隆化获得单克隆的抗体，筛选后获得具有原酶活性的抗体酶。,引入法,（1）借助基因工程和蛋白质工程将催化基团（特定的氨基酸残基）引入到已有底物结合能力的抗体的抗原部位结合位点上，获得抗体酶。（2）对于已产生的单抗，分析抗体结合部位的氨基酸顺序或对应的碱基顺序。然后通过对抗体酶结合部位氨基酸对应的基因序列进行定点突变，希望能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基酸。进而改变抗体酶的催化效率。,抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。,化学修饰法,稳定过渡态法制备抗体酶,酶催化机理：稳定过渡态（transitionstatestabilization）、酸碱催化、亲电和亲和催化、邻近效应（strainandproximityeffect）通过理论设计合适的与反应过渡态类似的小分子为半抗原，然后让动物免疫系统产生针对半抗原的抗体，这种抗体在几何形状和电学性质上与反应过渡态互补，形成稳定过渡态，加速反应。,如：Napper用环化的磷酸酯作为过渡态类似物，动物免疫获得单克隆抗体24B11，该抗体酶可催化外消旋的羟基羧酸酯分子内环化形成内酯，加速反应167倍，同时表现出很高的对映体和立体选择性。用于手性拆分的应用,52,抗体与半抗原互补法,抗体与其配体的相互作用是相当精确的，抗体常含有与配体功能互补的特殊功能基。已经发现带正电的配体能诱导出结合部位带负电残基的配体，反之亦然。,Shokat利用抗体与半抗原之间的电荷互补性，制备了针对带正电半抗原的抗体，结果在抗体结合部位产生带负电的羧基，可作为一般碱基催化-消除反应。在抗原结合部位诱导出2个催化基团（2个酸/碱）。,抗体酶的应用前景,1、抗体酶在帮助戒毒方面的应用Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。,抗体酶用于肿瘤治疗,目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。前药(prodrug)是指由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。,静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性。,抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。构建有别于天然功能酶的新酶类，是酶工程研究的又一前沿领地。,59,印迹酶,以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构造合适，这种聚合物就像“琐”一样对钥匙具有选择性识别的作用-分子印迹。主-客聚合作用或模板聚合作用,类似于抗体、CD模拟酶和天然酶的的结合部位，能否在聚合物中产生？分子印迹技术。,分子印迹聚合物的制备方法,1.选定印迹分子和单体，充分作用2、在印迹分子周围发生聚合反应3、印迹分子从聚合物中抽提出来。聚合反应条件的控制：溶剂、交联剂的浓度等。聚合物的形态有块、珠、薄膜、表面印迹等，最常规的是整块聚合物，然后粉碎过筛，获得不同粒径。用乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合可获得粒径均一的整粒。,印迹分子与聚合单体的结合,印迹分子与单体相互作用的类型：共价可逆结合（预组织法）、非共价结合（自组织法）。共价结合：印迹分子预先共价联结到单体上，聚合后共价键可逆打开，除去印迹分子结合部位的官能团预先与印迹分子定向排列。非共价结合：印迹分子与功能单体预先自组织排列，一非共价健形成多点相互作用，聚合后这种作用保存下来。聚合物与印迹分子间的作用力的强弱是影响分辨力的重要因素，两者间的相互作用力越多（离子键、氢键等），键的数目又多，聚合物的识别能力越强。,可逆共价结合法,例：印迹分子苯基-D-甘露吡喃糖苷的-OH与乙烯基苯基硼酸形成可逆共价结合，交联剂下，经自由基聚合产生具有大量内表面积的微孔聚合物，酸水解除去印迹分子，得印迹聚合物。对D型糖苷有选择性识别，在适当溶剂中，该空腔只与D型对映体建立平衡并与之结合。缺点：携带适当结合基团的聚合单体数量有限，应用范围受限。,非共价结合,例：印迹分子苯丙氨酸衍生物与聚合单体甲基丙烯酸通过离子键、氢键、疏水作用相结合。比共价结合法优越，可使用不同的单体、洗脱印迹分子的过程更加简单。,印迹技术的特点,印迹技术可以产生对底物的特异性结合部位。将催化官能团以确定的排列引入结合部位。底物必须与印迹分子的结构、大小相似，并能与催化官能团相结合。热力学控制的拆分（对映体选择）：决定因素是空隙内功能基的取向，形状选择性是第二位的。动力学控制的拆分：主要受平衡结合常数的影响，孔穴的形状是最重要的识别因素。,65,表面分子印迹,在载体表面产生分子印迹空腔或进行表面修饰产生印迹结合部位的过程。1无机物为载体的表面印迹如：将3-（三甲氧基硅烷基）甲基丙烯酸共价结合在大孔硅胶表面，引入