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生物化学实验实验一 酶联免疫吸附试验(8学时)一、实验目的1. 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理2. 学习间接竞争法检测抗原物质的基本操作二、实验原理酶联免疫吸附测定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Asay，简称ELISA)是在免疫酶技术上发展起来的一种新型免疫测定技术，是应用酶标记的抗体 (或抗原)在固相支持物表面检测未知抗原 (或抗体)的方法。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。竞争法ELISA的过程主要包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，封闭未被占据的吸附位点后，加入一定量特异性抗体和样品，吸附的抗原和样品中的抗原与抗体竞争结合。再加相应酶标记抗体，生成抗原-抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，各孔的吸光度值与样品中抗原的浓度成反比。为提高检测的灵敏度，通常在酶标板上加入样品和抗体之前，先将两者以一定比例混合，于4 预孵育16 h左右。酶联免疫吸附试验是利用抗原-抗体的免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在ng水平。酶联免疫吸附试验中所使用的试剂都比较稳定，按照一定的实验程序进行测定实验结果重复性较好，有较高的准确性。酶联免疫吸附法成本低，操作简便，可同时快速测定多个样品，不需要特殊的仪器设备。三、实验器材与试剂实验器材1. 96孔聚苯乙烯微量细胞培养板2. 八道移液器 (300 L)、单道移液器 (200L、1000L)3. 电子天平4. 恒温培养箱5. 离心机6. 酶联免疫检测仪 (酶标仪)实验试剂1. 包被液：0.05 mol/L pH9.6 碳酸缓冲液 (Na2CO3 0.15 g，NaHCO3 0.293 g，蒸馏水稀释至100 mL)，4保存。2. 稀释液：0.01 mol/L pH7.4 PBS-Tween-20 (NaCl 8 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO412H2O 2.9 g，Tween-20 0.5 mL，蒸馏水加至1000 mL)，4保存。3. 洗涤液：同稀释液。4. 封闭液：5%豆粉，pH9.6 碳酸缓冲液。5. 酪蛋白溶液：15.6 ng/mL、31.2 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL和4000 ng/mL。6. 鲜奶。7. 酪蛋白抗体，工作稀释度为1:2000。8. 辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗兔IgG，工作稀释度1:1000。9. 邻苯二胺溶液 (底物)：临用前配制。0.1 mol/L 柠檬酸 (2.1 g/100 mL) 6.1 mL，0.2 mol/L Na2HPO412H2O (7.163 g/100 mL) 6.4 mL，蒸馏水12.5 mL，邻苯二胺10 mg，溶解后，临用前加30% H2O2 40 L。10. 终止液：2 mol/L H2SO4。四、操作步骤1. 包被：500 ng/mL酪蛋白，每孔150 L，37 孵育1 h后转入4 冰箱放置过夜；2. 洗涤：PBST洗板三次 (倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽)；3. 封闭：5%豆粉 (离心后使用)，每孔加300 L，37 封闭1 h；4. 洗涤：PBST洗板三次；5. 抗原抗体反应：将一定浓度的抗体或抗体和样品的混合物加入板孔 (提前预混合，4 过夜放置)，注意从高稀释度到低稀释度加样，每孔150 L，37 孵育2 h；6. 洗涤：BST洗板三次；7. 抗原抗体复合物与酶标二抗反应：加入酶标二抗 (辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔150 L，37 孵育1 h；8. 洗涤：PBST洗板三次；9. 显色：加入邻苯二胺溶液 (底物)，每孔100 L，37 ，闭光反应20 min；10. 终止反应：每孔加50 L 2 mol/L H2SO4 终止反应；11. 测定：用酶标仪于490 nm波长下测量各孔的吸光度值OD490nm；12. 数据处理：将测得的吸光度值OD490 nm扣除空白后，按照公式换算成抑制结合率B/B0(%)。以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值为横坐标作图，绘制标准曲线，标准曲线用线性拟合。五、注意事项1. 正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min再弃去。2. 加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。3. 底物应在临用前配制，同时注意避光。六、思考题请查阅相关文献，指出ELISA有哪几种常用方法？各种方法在操作上有什么异同？应用有什么异同？实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量 (8学时)一、实验目的1. 学习电泳原理和技术2. 学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术二、实验原理蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之则向负极移动，这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳(electrophoresis)。不同的蛋白质由于等电点不同，在电场中的泳动速率也不同，因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate -polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N, N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和增速剂(N,N,N,N-四甲基乙二胺)的氧化-还原作用下聚合而成的。凝胶的有效孔径与它的总浓度T%成反变关系，在高浓度时，凝胶孔径小，可以筛分分子量小的多肽；低浓度时，凝胶孔径大，则可筛分大分子蛋白质。工作时，凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，浓缩胶浓度低、孔径大，较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可被浓缩至一极窄的区带，以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。SDS是一种阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT)或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样本中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合，可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；然而，蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。因此，当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15 KD到200 KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定，蛋白质纯度的分析，蛋白质浓度的检测，免疫印迹 (Western Blot)的第一步，蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等。三、实验器材与试剂实验器材1. 垂直板电泳槽2. 稳压稳流电泳仪3. 脱色摇床实验试剂：1. 丙稀酰胺和N, N-亚甲双丙稀酰胺配制的29% (w/v)丙稀酰胺和1% (w/v) N, N-亚甲双丙稀酰胺的贮存液，置于棕色瓶中贮存于室温。小心：丙稀酰胺和N, N-亚甲双丙稀酰胺具有很强的神经毒性并容易被皮肤吸收。2. 10%十二烷基硫酸钠 (SDS)贮存液。3. 1 M pH 6.8的Tris缓冲液和1.5 M pH 8.8的Tris缓冲液。4. 过硫酸铵。5. TEMED (N, N, N, N-四甲基乙二胺)。6. Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25 mM Tris； 250 mM 甘氨酸 (pH 8.3) 0.1% SDS7. 样品处理液配方：50 mM Tris-HCl (pH 6.8) 100 mM DTT (or 5%巯基乙醇) 2% SDS 0.1%溴酚蓝 10%甘油9. 染色液：0.1%考马斯亮蓝R-250；40%甲醇；10%冰醋酸10. 脱色液：10%甲醇；10%冰醋酸四、实验方法SDS聚丙稀酰氨凝胶的灌制1. 安装玻璃板。2. 称取0.1 mg琼脂或琼脂糖于一小三角瓶或小烧杯中，加入10 ml Tris-甘氨酸电泳缓冲液，微波炉加热沸腾。用滴管或1 ml微量移液器吸取琼脂，对玻璃板各缝隙进行封口。封口后的玻璃板放入4冰箱冷藏约20分钟，使琼脂凝结牢固。3. 按表1中给出的数值在一小烧杯中配制分离胶溶液。注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。表1 10%分离胶溶液的配制溶液成分总体积10 mL水2.3 mL30%丙稀酰胺5.0 mL1.5M Tris (pH8.8)2.5 mL10% SDS0.1 mL10%过硫酸胺0.1 mLTEMED0.004 mL4. 迅速在玻璃板的间隙中灌注丙稀酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需的空间 (梳子的齿长再加0.5 cm)。再在胶面上小心注入一层水 (约23 mm)高，以阻止氧气进入凝胶溶液。5. 将胶板放入37温箱1小时以上，待分离胶聚合完全后，倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。6. 按表2中给出的数值制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。表2 5%浓缩胶溶液的配制溶液成分总体积5 mL水3.40 mL30丙稀酰胺0.83 mL1M Tris (pH6.8)0.63 mL10% SDS0.05 mL10%过硫酸胺0.05 mLTEMED0.005 mL7. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下或置于37温箱中保温。8. 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100加热3分钟以使蛋白质变性。9. 浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，注意胶板上开口朝向负极 (黑色)，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。上样电泳1. 按预定顺序用微量移液器加样，加样量通常为1020 L。2. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/ cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。染色和脱色1. 染色时间：1520 min。2. 脱色需310小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为了永久性记录，可对凝胶进行拍照，或者将凝胶干燥成胶片。五、注意事项1. 凝胶不聚合的可能原因：试剂质量差，应使用电泳级别的试剂。过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液。凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。2. 经过煮沸的样品虽然可以在-20保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。3. 注意避免电泳条带弯曲畸变：“微笑”现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善；“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀；“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服；“晕轮”效应 (holo effect)多为加样过量所致。4. 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。六、思考题1. 蛋白质的分辨范围为什么与凝胶中丙烯酰胺的浓度有关？2. 如何克服SDS-PAGE中遇到的条带弯曲畸变现象？实验三 CM-纤维素离子交换层析柱法分离卵清蛋白组分（8学时）一、实验目的1. 掌握离子交换柱层析的分离原理与方法。2. 熟练掌握蛋白质紫外吸收分析方法。二、实验原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为：阳离子交换反应：( RX- ) Y+ + A+ ( RX- ) A+ + Y+阴离子交换反应：( RX+ ) Y- + A-( RX+ ) A- + Y-其中R 代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X-和X+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+和Y-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+和A-分别代表溶液中的离子基团。从上面的反应式中可以看出，如果A 离子与离子交换剂的结合力强于Y 离子，或者提高A 离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A 离子将Y 离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。三、实验器材与试剂1. 材料：鲜鸡蛋一个，CM-纤维素32（whatman）2. 试剂：缓冲液0.02M PBS（pH6.8），NaCl3. 仪器：恒流泵，紫外检测仪，记录仪，自动部分收集器。四、实验方法1. 凝胶的溶胀与预处理先打开紫外检测仪，并将测量选择旋扭旋至T。2. 装柱立起柱子，关闭柱底部的出口，将CM-纤维素32注入柱子，静止约30分钟，然后打开柱底部的出口，让缓冲液从柱中流过。待缓冲液高于凝胶界面约3-5厘米时，关闭底部出口，于柱顶部接上柱液流接头（注意：在接之前，务必使上柱充满缓冲液，否则会带入气泡）。将上液流接头与泵连接，注意不要进气泡。开始用泵装压柱子，注意调节流速。预平衡（用缓冲液冲23个柱床体积）3. 上样样品的制备：取卵清，用缓冲液20X稀释，离心（3000rpm/min，10min），取上清（粘的部分含有大量的卵蛋白），每组取15 mL上样。上样（保证样品能被吸附。如果样品太浓要进行适度的稀释，太稀的话可以进行适当的浓缩）。停泵，将缓冲液换成样品，注意排气泡。再将泵打开。4. 冲柱（用缓冲液冲2-3个柱床体积）停泵，将样品换成缓冲液，注意排气泡。再将泵打开。5. 洗脱：分别用0.1M, 0.5M, 和1M的NaCl将蛋白洗脱下来（每种浓度洗2个柱床体积，再换成下一个浓度，中间换浓度时注意停泵，排除气泡）。6. 洗柱：用PBS缓冲液洗柱1-2个柱床体积。用蒸馏水清洗紫外仪、柱头及所有进液软管。7. 作柱层析图：分步收集器中试管每隔两管取一管在722分光光度计280 nm测OD值，以管号为横坐标，以OD280为纵坐标，作柱层析图。五、注意事项1. 凝胶溶胀时不要剧烈搅动。凝胶要回收。2. 层析柱一定要装均匀，否则会影响分离效果。六、实验报告1. 内容与要求：实验目的与要求、实验原理、主要实验步骤与结果观察、结果与讨论。2. 思考题本实验操作中特别需要注意的是什么?为什么?离子交换层析的原理是什么?实验四 枯草杆菌蛋白酶活测定（8学时）一、实验目的1学习测定酶反应速度的基本方法，并了解其重要意义。2掌握测定枯草杆菌蛋白酶活力、比活力的原理和方法。3深入了解酶的活力及比活力的概念。二、实验原理生物机体内的大部分化学反应都是在酶的催化下进行的。检查酶的存在不能直接用重量或体积表示，而用它在一定条件下催化某一化学反应的能力来表示，即用酶活力表示。测定酶活力就是测定酶所催化的化学反应速度。酶的比活力是每毫克酶蛋白所催化的反应速度。酶反应速度可以用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的生成量来表示。为了灵敏起见，通常测定产物的生成量。将反应物浓度对反应时间作图，得出速度曲线。根据 = 浓度变化/单位时间，速度即为时间的斜率，酶促反应速度随反应时间的推移而逐渐降低。所以一般以酶促反应的初速度来测定酶活力。采用酪蛋白为底物，待酶促反应完毕后，用蛋白沉淀剂除去未被分解的蛋白质，然后测定释放出来的酪氨酸量，以表示蛋白酶的活力。在第一次实验考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度时，已经测定了蛋白质的浓度。将酶浓度除蛋白质浓度，即可得到蛋白酶的比活力（由于酶制剂所含蛋白并非全部为蛋白酶酶蛋白，故所谓比酶活只能是一个大概值）。三、实验器材与试剂实验器材恒温水浴锅；分析天平；0.15 mL吸管；722型分光光度计；试管及试管架；秒表；小漏斗；与小漏斗大小相当的滤纸。实验试剂1. Folin-酚试剂乙；2. 10%三氯乙酸溶液；3. 0.55M Na2CO3溶液；4. 0.02 M pH 6.0磷酸盐缓冲液；5. 5%酪蛋白溶液；6. 标准酪氨酸溶液； 7. 标准蛋白质溶液：（需经凯氏定氮测定纯度）配成500g/mL的蛋白溶液；8. 中性枯草杆菌蛋白酶（Novozyme）。四、实验方法1. 酪氨酸标准曲线的制作取7支试管，分别加入0、0.20、0.40、0.50、0.60、0.80及1.00 mL标准酪氨酸溶液（50 g/mL），用水补足到1.00 mL，再各加5.00 mL 0.55 M碳酸钠溶液，最后加入0.50 mL Folin-乙试剂，摇匀。于室温下放置30分钟（或在30恒温水浴中放置15分钟），于680 nm 721分光光度计上比色，以酪氨酸的浓度（g/mL）为横坐标，以光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2. 样品测定取10 mg枯草杆菌蛋白酶于10 mL离心管中，加入10 mL 0.02 M、pH 6.0磷酸盐缓冲液浸泡30分钟，其间经常用玻璃棒搅拌，然后在4000 rpm离心10分钟，倒出上清液备用。将枯草杆菌蛋白酶上清液稀释1-10倍待用。样品：取20200 mm试管1支，放入10 mL 0.5%酪蛋白溶液，同时另取1支16160 mm试管，吸取5.00 mL稀释后的枯草杆菌蛋白酶上清液，两管于55恒温水浴中预热5分钟后，迅速将酶液倒入酪蛋白溶液中混合摇匀，继续放入55水浴中保温，记录时间，分别于5、10、15、25分钟准确吸出2 mL（注意：吸取2.00 mL酶底物反应液后迅速将剩余溶液的试管放入55水浴锅中继续保温，不要放在实验台上），立即依次加到盛有2.00 mL 10%三氯乙酸的试管中，摇匀后，静置片刻，用定性滤纸过滤（不要用蒸馏水润湿滤纸，否则会影响溶液浓度应直接加），取1 mL滤液，分别加入5 mL 0.55 M碳酸钠溶液和0.50 mL Folin-乙试剂，30恒温水浴中放置15分钟680 nm比色测定。对照：在1支16160 mm试管中加入2 mL酶液，将酶液煮沸5分钟变性（亦可用三氯乙酸变性）。再取1支16160 mm试管，加入4.00 mL 0.5%酪蛋白溶液中。两管于55恒温水浴预热5分钟后，混合并摇匀，分别于5分钟取样2 mL，加到2 mL 10%三氯乙酸中，同样静置片刻，用定性滤纸过滤。取1 mL滤液，分别加入5 mL 0.55 M碳酸钠溶液和0.50 mL Folin-乙试剂，30恒温水浴中放置15分钟，680 nm比色测定。空白：取1 mL蒸馏水代替滤液同样方法进行比色测定。名称酶（mL）0.5%酪蛋白（mL）取样时间（min）取样量（mL）10%三氯乙酸（mL）滤液（mL）0.55M Na2CO3（mL）Folin-乙试剂（mL）空白蒸馏水1.005.000.50样品5.0010.0052.002.00滤液1.005.000.5055预热、保温102.002.001.005.000.50152.002.001.005.000.50252.002.001.005.000.50对照(煮沸) 2.004.0052.002.001.005.000.50本实验中每克蛋白酶的活力单位IU=p：测得光密度值OD对应于酪氨基酸标准曲线酪氨酸的浓度（g/mL）；5：5分钟；：加入酪蛋白底物时酶被稀释的倍数；：加入三氯乙酸时酶底物反应液被稀释的倍数；10：10 mL磷酸缓冲液的体积数；M：样品的克数；X：枯草杆菌蛋白酶上清液稀释倍数181：酪氨酸的分子量。根据上次蛋白含量测定的结果，求出每克蛋白酶中含有的蛋白质的毫克数。蛋白酶的比活力=五、注意事项酶液上清液需要稀释，使其能催化蛋白质分解产生的氨基酸的浓度位于标准曲线范围之内。六、实验报告内容与要求：实验目的与要求、实验原理、主要实验方法与结果观察、结果与讨论，画出酪氨酸标准曲线EXCEL散点图（附上回归方程和R2），计算出酶活力单位，画出不同反应时间酶底物反应液中酪氨酸的浓度（注意：以反应液中的酪氨酸浓度计）散点图曲线（折线图），计算比活力。思考题：三氯乙酸与过滤各起什么作用，如果没有这两步结果会怎么样。实验五 氨基酸的纸层析 (备选)一、实验目的1. 掌握纸层析的基本技术。2. 学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。二、实验原理纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数层析溶剂 (又称推动剂)，是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力 (纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用)能吸附很多水分，一般达滤纸重的22%左右 (其中约有6%的水与纤维素结合成复合物)，由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆