分子神经生物学作业.docx

分子神经生物学研究方法的名称，原理和应用此方法所达到的目的21世纪是生物学世纪，生命科学已成为科学的前沿，而分子生物学技术又是生命科学中公认的一门带头学科。现在，分子生物学理论和技术已在生命科学、医药学和工农业生产等领域得到广泛应用，大大推进了学科的发展。为了进一步促进分子生物学技术在神经科学研究中的应用，我们要学会用研究分子神经生物学的理念和方法。一 1.RNA分析技术2 荧光定量PCR技术与应用3 外源基因在原核、真核系统中的表达4 蛋白质分析技术5 基因芯片技术与应用6 细胞凋亡的检测与分析7 激光共聚焦显微镜的原理和应用8 基因诊断与治疗9 干细胞诱导与分化1.RNA分析技术关于基因功能研.是一种有效(快捷和成本相对低廉的方法大鼠成纤维细胞和小鼠细胞!分别抑制了哺乳动物的!个不同类型基因!均获得成功!并重新界定了部分必需基因和非必需基因#现在人们把该技术与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在基因组水平上筛选成百甚至上千基因!在基因组学功能研究中发挥着越来越大的作用!其应用前景不亚于QF9 技术例如!人们选取果蝇基因组中的基因分别作为模板!用包含UO启动子的序列作为通用引物!通过QF9 进行体外转录形成对胚胎进行微注射并进行抗体和免疫组织化学分析!从而在基因组中筛选出果蝇心源性基因。不但应用研究了哺乳动物细胞中某些关键基因的作用!还探索了在基因组水平上的筛选方法他们从人类基因文库中选出靶基因。每个基因设计两个靶序列，应用 表达系统产生表达盒并构建 表达框文库通过它来高通量筛选:WMG信号途径中已知的及未知的特有基因从而为疾病治疗提供有用信2. 荧光定量PCR技术与应用概述荧光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步应用领域TL988型实时荧光定量PCR仪应用领域 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。 动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。 3 外源基因在原核、真核系统中的表达血管内皮生长因子能特异性作用于血管内皮细胞,促进其增殖,加速新生血管形成,增加血管通透性。VEGF已成功用于治疗肢体及冠状动脉缺血,对脑缺血性损伤的治疗还处于初步研究阶段,有研究发现VEGF除具促血管发生外,尚有直接的神经保护和促神经发生等作用。但脑内直接注射VEGF因子,需反复给药、价格昂贵、且易造成颅内感染。直接应用携带VEGF基因的质粒存在表达不足,而腺病毒又存在安全隐患等问题。本实验以增强型绿色荧光蛋白作基因转移报告物和移植示踪物,构建EGFP-VEGF融合蛋白的真核表达载体,转染体外培养的神经干细胞,随后观测VEGF在该干细胞中的表达变化,为进一步研究VEGF修饰的NSCs治疗缺血性脑损伤奠定基础4 蛋白质分析技术：基因芯片技术和蛋白质组技术是最近发展起来的高通量技术 ,二者的出现使同时分析神经系统的大量基因的表达和基因产物蛋白质及其相互作用网络成为可能。它们在神经科学中的应用为了解脑功能提供了前所未有的机会。一个典型的基因芯片实验包括 :芯片的准备或购买、靶DNA和探针的准备或标记、标记探针与靶DNA的杂交、芯片扫描和影象信息的数据分析。蛋白质组技术较为复杂 ,包括蛋白质分离、鉴定和信息分析三方面的内容。其中 ,分离技术多种多样。若分离技术以二维电泳为基础 ,则该实验通常由以下步骤组成 :蛋白质样品的准备、电泳分离、染胶、分离蛋白点的切除、蛋白质的酶解 (常用胰蛋白酶 )、质谱分析 (鉴定 )和数据的信息处理。本文综述这两项技术的内容和实验步骤 ,然后着重叙述它们在神经科学中的应用 ,讨论其优缺点和面临的挑战 ,展望其发展前景5 基因芯片技术与应用基因芯片 技术 ,是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针 ,有规律地排列固定于玻片或者尼龙膜等支持物上 ,然后与待测的标记样品的基因进行杂交 ,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描 ,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出检测和比较 ,从而迅速得出所要信息的一种分子生物学技术。上世纪 90年代初 ,Bains等将短的片段固定到DNA支持物上 ,借助杂交方式进行序列的测定。Pease等 (1994 )创造了光导原位合成 高密、微化的寡核苷酸阵列的制作技术 ,为DNA芯片技术的产生奠定了分子技术基础。后来出现的探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术结合 ,使合成并固定高密度的数以万计的探针分子成为可能 ;并借助激光共聚焦显微扫描技术对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析 ,促使基因芯片技术由实验室走向工业化6 细胞凋亡的检测与分析细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,对于多细胞生物个体发育的正常进行,自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰都起着非常关键的作用。细胞凋亡具有鲜明的形态学和生化特征,如细胞萎缩、染色质固缩、凋亡小体形成、细胞表面形成泡状或芽状突起。细胞凋亡最主要的生化特征是DNA发生核小体间的断裂,产生含有不同数量核小体单位的片段,在进行凝胶电泳时,产生特征性的梯形条带(DNAladder)。其大小为160220bp的整数倍1。与上述形态学及生化特征相对应,细胞凋亡常用的检测方法有细胞形态学观察法2、琼脂糖凝胶电泳法1、DNA断裂的原位末端标记法3、彗星电泳法和流式细胞分析法4,5。高效毛细管电泳(CE或HPCE)相对传统琼脂糖凝胶电泳具有高效、高速、样品用量少、易实现仪器自动化等优点,已常规地应用于核酸、蛋白质、药物、糖类以及各种其它小分子、离子等的分析7 激光共聚焦显微镜的原理和应用1定量荧光测定：对活细胞进行定量测定，具有很好的重复性，分析神经细胞和胶质细胞的某些物理及生物化学特性；监测抗原表达，细胞结合和杀伤等特征。在多发性硬化病人大脑活检标本上观察病变组织的微血管内皮细胞特异性地表达。 2细胞内离子的测定：使用多种荧光探针，对神经细胞的Ca2+、PH及其它各种细胞内离子进行定量和动态分析。 .3 神经细胞的形态学观察：激光扫描共聚焦显微镜使用模拟荧光处理，可将系列光学切片的数据合成三维图像，并可从任意角度观察。如Joshi等观察了细胞突触的骨架的三维图像。三维重建图像可使神经细胞及细胞器的形态学结构更加生动逼真。8 基因诊断与治疗1995年以前,脊髓性肌萎缩症(spinal museularat娜by,sMA)的诊断主要依靠病史、临床表现、肌电图及肌肉活检组织化学染色等。但SMA的临床变异性大,肌电图在儿童患者不易配合检查,肌肉活检为有创性检查,令家长难以接受,且需冰冻切片组化染色的条件,更难以在临床上广泛开展,即使可以推行,肌电图和肌肉活检亦均缺乏特异性,因此本病极易误诊。1995年,玩fevre等克隆到sMA的基因,并发现98.7%(226/229)的患者存在运动神经元存活基因l(survival motor neuron以邵nex,sMNI)缺失或中断,这使得检测SMNI基因缺失进行本病的基因诊断成为可能。发展至今,基因诊断已成为SMA的主要确诊方法,在国内外广泛推行,用于基因诊断的号外显子缺失,则仅见120娜和招坤两个条带,由技术和方法也在不断改进与提高9 干细胞诱导与分化在脊髓受损、肌萎缩性脊髓侧索硬化和脊骨肌萎缩等多种情况下，人体内会出现运动神经细胞缺失现象。该研究展示了利用多能干细胞分化的运