【毕业学位论文】（Word原稿）奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及应用动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及应用 n 要 本研究 通过对 奶牛乳腺上皮细胞 的 培养方法 的筛选 ， 培养出生理功能正常的奶牛乳腺上皮细胞，以该细胞为模型，研究棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞 生长、胞液脂质小滴的形成、 脂肪酸 合成 及其相关酶 基因 表达的影响。 从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织，通过不同的方法分离、培养、纯化 奶 牛乳腺上皮细胞，研究 奶牛 乳腺上皮细 胞的体外培养效果。结果表明：组织块接种、 胰酶和 100u/明质酸酶的混合液 37消化组织块 3h，可以得到大量细胞用于原代培养。在以 基础培养液，在培养液中添加 10%的胎牛血清、 100ug/双抗、 表皮生长因子（ 10ng/、胰岛素 （ 、氢化可的松 （ 1ug/、孕酮（ 1ug/转铁蛋白（ 5ug/谷氨酰胺 （ 等，组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好。显微结构显示：奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中含有不同的细胞类型，大多数上 皮细胞呈多角形，细胞之间连接成片，细胞界限明显，部分细胞界限不明显。 用 测奶牛乳腺上皮细胞 分泌 的 以 鉴定该细胞的生理功能是否正常；通过染色体的数目及核型 分析 以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示：培养液中含有 明该乳腺上皮细胞生理状况良好；染色体数目正常，染色体数目为 60，核型与 哺乳动物 染色体图谱一致，说明该细胞系在体外培养条件下未发生转化。 奶牛乳腺上皮细胞培养液中 添加 游离 脂肪酸 ， 包括棕榈酸、硬脂酸 、 油酸、亚油酸， 研究外源 脂肪酸 对乳 腺上皮细胞生长 、 胞液中脂 质小 滴 的 形成 、细胞脂肪酸合成 以及脂肪酸合成关键酶 达量的影响。结果显示， 棕榈酸、硬脂酸 、 油酸、亚油酸 对 细胞 的 生长都有抑制作用， 抑制 作用 随着 脂肪酸的 添加量 和 不饱和程度 的增加而增加 ； 油酸、亚油酸 对胞液中脂质小滴的合成有促进作用 ，而 棕榈酸、硬脂酸 没有这种作用 ； 棕榈酸、硬脂酸 、 油酸、亚油酸 都能抑制细胞内脂肪酸的从头合成； 棕榈酸、硬脂酸 、 油酸、亚油酸 对 表达有 抑制 作用，对 表达有促进作用。 关键词 ： 奶牛乳腺上皮细胞 体外培养 游离 脂肪酸 on of to on of in of of in of in to be 00u/mL h 7 0% 100ug/mL (10ng/ 1ug/ 5ug/ 1ug/ in of of of to in in in of in of it 0, in e on of in of in a 00 00uM to in as as A; by of by In 录 第一章 绪 论 . 1 内外研究进展 . 1 腺的生物学研究 . 1 腺上皮细胞体外培养研究概况 . 2 胞脂肪酸合成相关酶的研究进展 . 8 在的问题 . 13 研究目的及意义 . 13 第二章 奶牛乳腺上皮细胞体外培 养条件的 筛选 . 14 料与方法 . 14 胞来源 . 14 剂与器材 . 14 牛乳腺上皮细胞的获取方法 . 14 牛乳腺上皮细胞的培养方法 . 15 果 . 16 同方法获得奶牛乳腺上皮细胞的比较 . 16 牛乳腺上皮细胞在不同培养液中生长的比较 . 17 牛乳腺上皮细胞的形态观察 . 18 论 . 20 第三章 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定 . 22 料与方法 . 22 料 . 22 剂与仪器 . 22 抗牛 . 22 测奶牛乳腺上皮细胞分泌的 . 24 牛乳腺上皮细胞染色体核型分析 . 28 果 . 29 v 血清效价的检测 . 29 牛乳腺上皮细胞分泌 . 29 色体核型分析 . 29 论 . 29 第四章 游离脂肪酸对奶牛乳腺上皮细胞的影响 . 31 料与方法 . 31 料 . 31 胞毒性试验（ . 31 胞油红 O 染色 . 32 提 取 . 32 反转录及 测 . 32 量 增效率的检验及反应体系 . 34 牛乳腺 上皮细胞脂肪酸的测定 . 34 果 . 35 离脂肪酸对细胞生长的影响 . 35 红 O 染色 . 36 离脂肪酸对 达量的影响 . 37 离脂肪酸对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成的影响 . 38 论 . 39 第五章 总体结论 . 41 牛乳腺上皮细胞体外培养 . 41 离脂肪酸对奶牛乳腺上皮细胞 的影响 . 41 新点 . 41 待进一步研究的问题 . 41 参考文献 . 42 致 谢 . 49 作者简历 . 50 略语英汉对照表 缩略语 英文 中文 oA 酰辅酶 A 羧化酶 介苗 牛乳腺上皮细胞 s s 限必需培养基 甲基亚砜 细胞外基质 皮生长因子 肪酸合成酶 牛血清 离脂肪酸 长激素 氨酰胺 根过氧化物酶 化可的松 岛素生长因子 岛素 离 脂肪酸 -(4,5)3,5甲基噻唑二苯基四唑溴盐 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 PG 酮 脂酸脱饱和酶 二烷基硫酸钠 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 内外研究进展 腺的生物学研究 乳腺在胚胎早期由外胚层较厚的区域分化而来。随着胚胎的发育在胎儿形成期乳腺逐渐形成乳蕾，从出生到青春期乳腺不断分化增殖、乳导管也形成完善。这种青春前期的生长在不同的物种之间差异较大。发育成熟的乳腺出现树枝状的小叶网状导管和实质性细胞（上皮细胞、肌上皮细胞、原代细胞和干细胞）它们弥散在乳腺基质中。乳腺基质由中胚层发育而来的细胞（主要是不同发育阶段的脂肪细胞和成纤维细胞），细胞外基质和血管、淋巴以及神经组成。 母畜达到性成熟后，乳腺在发情周期 中经历生长发育的周期性变化。在每次的发情周期卵泡期，乳腺导管系统迅速生长，并在黄体期开始形成少量发育不完全的腺泡。在间情期，乳腺停止生长，导管系统稍微缩小。在一次又一次的重复发情周期中，导管逐渐形成分支复杂的导管系统，乳房体积也明显增大。但一般不形成真正的腺泡 （ ， 1989） 。 妊娠开始后，导管系统的长度不再增加，每个细小导管的末端膨大形成腺泡。在妊娠前期，虽然腺泡已经发育，但缺乏腺泡腔。到妊娠中期，坚实的腺泡渐渐出现分泌腔，腺泡和导管的体积不断增大，同时乳房内的血管和神经纤维不断增生。 妊娠后期，腺泡进一步增大，腺上皮开始具有分泌功能 ， 同时小叶间和叶间的结缔组织都伸长和变薄 ， 临近分娩腺泡分泌乳汁。 乳脂的合成：乳脂几乎完全呈甘油三酯状态，组成甘油三酯的脂肪酸主要是 的饱和脂肪酸和油酸。在乳腺分泌上皮细胞的颗粒性粗面内质网中形成脂肪小球，然后被质膜包围排出细胞，形成乳脂。 合成乳脂的脂肪酸大部分来自乳腺上皮细胞的合成，小部分直接利用血液中的甘油三酯 （ ， 1996） 。 乳糖的合成：合成乳糖所需的半乳糖和乳糖都来源于血液中的葡萄糖。在乳糖合成酶的作用下，一部分葡萄糖 在乳腺内先转变成半乳糖， 然后再与葡萄糖结合生成乳糖。葡萄糖转变成 能在乳腺分泌上皮细胞内进行。 乳蛋白的合成：酪蛋白、 乳清蛋白，都是由乳腺分泌细胞合成的特殊乳蛋白。合成这些蛋白质的原料都是来自血液中的游离氨基酸。其中，必需氨基酸全部来自血液，非必需氨基酸一部分来自血液，一部分由乳腺分泌上皮细胞合成 （ ， 1993） 。 通常进入泌乳后期，乳腺开始回缩。 此时乳腺中的大部 分腺小叶丧失正常的功 能。腺上皮退化，细胞内的大部分胞浆被脂肪 组织 取代 。 反刍动物乳腺组织在哺乳期和干奶期所经历的周期性循环不同于啮齿类动物。反刍动物的乳腺萎缩较慢，当停止挤奶后由于腺泡组织部分收缩，乳腺萎缩加速。这个过程即组织重塑过程，包括细胞外蛋白水解活性调节和乳腺活动的周期性转换（ ， 1994）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 2 腺上皮细胞 体外培养研究概况 当有机体的细胞被置于体外环境中培养时，主要的体内调节因素丧失，细胞所面临的基本生活环境就是培养液 和 大为减弱的相邻细胞间的相互作用。失去了体内多方面调节因素的压力，细胞随即转向“ 自由”生长状态。增殖约束逐渐取消，分化特征逐渐减弱，原本各种各样的分化细胞逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出趋同性，这种现象被称为去分化（ 1991）。但是，一旦这些细胞重新获得类似体内的生存环境或调节信号，它们会重新表现出分化的特点。当然这种重新分化的能力会随着培养时间延长而逐渐丧失。总之，体外培养的环境使得培养的有机体细胞结构与功能上的“可塑性”增大。 培养的细胞除了去分化的特性之外，还可发生转化（ 象。转化细胞的 核型必然发生改变，转化细胞的性状可以随着细胞分裂传递给子代细胞。凡是诱发 生突变的物理、化学和生物因素都可以促使细胞发生转化。常用的物理因素包括紫外线、 X 射线、放射性核素等；常用的化学试剂有甲基甲磺酸、乙基甲磺酸、乙基亚硝基脲、甲基硝基亚硝基胍等；生物因素包括猴病毒 转录病毒、癌基因 。正常状态下，在体内的上皮细胞是一个逐渐衰老、死亡和脱落，并由新生细胞不断补充和更新的过程。但各种上皮细胞的更新速度不同。体外培养的上皮组织细胞的生命期主要经历原代培养、传代培养、 衰退或转化三个阶段。 原代培养阶段：是指最初从体内上皮组织分离并移植到体外进行培养的阶段。一般该阶段持续 1 4 周左右。此期细胞的特点是细胞移动活跃，有一定的分裂增生活动，并在细胞种类、细胞性状、细胞结构与功能上与体内原上皮细胞有着极大的相似性。 传代培养阶段：当原代培养的上皮细胞达到一定密度后，就必须进行传代培养。传代培养一般需降低细胞密度，传代的频率同培养基的性质、接种的细胞数量和细胞增殖的数量有关。如果不将细胞及早冻存，则需反复传代，一般情况下，细胞经过 6 10 代传代后，细胞的增殖会逐渐衰退，细胞性状也会改变，失去二倍体细胞的特性甚至发生细胞转化。在每一次人为的传代培养过程中， 用 蛋白酶将培养物消化制备成细胞悬液， 然后 再用于种植。种植后的细胞都要经历相似的恢复和生长过程。根据每一次传代的细胞生长变化的过程，习惯上把每一代细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段。 潜伏期是细胞对传代操作所致损伤的恢复期和对新的生长环境的适应期。研究表明：贴壁依赖性细胞使用蛋白酶消化处理时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤，全部细胞变为圆球形。接种到培养器皿内以后，细 胞开始经历与原代培养期内相似的黏附、贴壁、铺展等过程。接种的细胞密度越大细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。传代培养的细胞潜伏期要比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞，潜伏期一般为 6 24h。连续细胞系与发生恶性转化的细胞比有限细胞系与正常二倍体细胞的潜伏期短。当细胞开始分裂，意味着细胞已完全恢复生长状态，潜伏期结束。 潜伏期结束即开始指数生长期，或称对数生长期（ 它是细胞增殖最快、细胞活力最旺盛的阶段，培养液中的细胞数量呈指数增长。指数生长期内细胞的 增殖活性可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标，常以细胞群体倍增时间来表示。在接种的细胞数量适中、培养条件适宜的情况下，指数生长期一般持续 3 5d，细胞即可长满培养器皿，相互汇合成片。如果培养的是正常的二倍体细胞，当细胞相互连接片时，细胞便不再运动，表现出由于接中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 3 触而相互抑制的特征，此即为接触抑制（ 肿瘤却没有接触抑制现象，于是会在所形成的单层细胞层上继续堆叠。细胞在发生接触抑制以后，虽然运动受到抑制，但是只要营养成分充足，仍然可以进行短期的分裂增殖。只有细胞厚度变高， 使 成受到抑制时，细胞便不再分裂增殖。此时， 如果 培养液中营养供应不足，会因细胞密度增大而产生密度依赖型细胞生长抑制（ of 当细胞分裂停止后，细胞数量发生“停滞”不再增加。 停滞期（ 称平台期 （ ，即此时细胞长满整个培养底壁。细胞不再分裂增殖，细胞数维持在某一水平上，生长活动停滞，进入衰退或转化阶段。体外培养的上皮细胞在此阶段不增殖或增殖很慢，细胞的形态紊乱，轮 廓增强，甚至出现细胞凋亡，这种现象多发生在传代末期。但在少数情况下，一些体外培养上皮细胞在一些因素的影响下，细胞发生转化，上皮细胞的接触性抑制特性消失，同时细胞获得持久增殖能力并保持细胞的某些相关性状，即细胞的永生性。具有永生性的细胞群体，也被称之为无限细胞系或连续细胞系。此外，体外培养 的 细胞转化后，细胞核型有可能异倍体化，使细胞具有恶性性质，即细胞的恶性化（ 在过去的十 多 年里，多种体外培养方法被用来描述乳腺在不同生长阶段和生理时期的生长和形态变化。在这些研究中包括细胞与细胞之间的相 互通讯，组成乳腺的不同细胞之间的相互关系 ，基质的影响 ， 激素、生长因子、生长抑制剂的影响 等 （ 003）。在这些研究中主要用到的技术有：完整器官培养（主要应用于小型试验动物）；移植培养；原代培养（无变异、分化的细胞）， 以及 来自乳腺组织和原代细胞的永生细胞。值得 关注 的是，目前关于乳腺生物学的知识主要是建立在 对 人和啮齿动物 乳腺 的研究 之上 ，而 对 反刍动物的乳腺生物学 研究较少 。 植培养 乳腺移植主要用来研究鉴定细胞特殊分泌物如：牛乳 转铁 蛋白、脂肪酸 黏合 蛋白 等 。牛的乳导管移植用来研究和乳导管 组织抗菌相关联的培养条件， 随着近年来 乳腺采样方法的发展，将来乳腺移植的研究会越来越广泛（ 1994）。 移植培养最大的优点是保持了乳腺的天然成分和组织特殊的体系结构。移植培养在丰富的血清条件下，研究一般的激素如生长因子，生长抑制因子等在接近体内环境下对乳腺发育和退化。同时，移植培养也存在一些难题： 1）移植组织可能携带一些生长因子、生长抑制因子以及一些激素等，它们在体外培养的过程中可能存在活性。 2）针对原代细胞添加的一些外源因子 会受影响 。3）细胞数目 过多 对有丝分裂的影响。 此外， 移植培养维持时间 短 也是一个制约因素。 代培养 新鲜分离的上皮细胞可能与体内的上皮细胞具有同样的生理学和新陈代谢特点。它们在形态、生理以及新陈代谢反应最接近体内上皮细胞的状态。另外，不同生理时期动物采集的样品其培养的最初生理特点是不一样的。 （ 1991），建立了牛乳腺上皮细胞的分离和培养方法。自那以后，从牛、绵羊、山羊分离的原代 乳腺上皮细胞 培养才真正开始 了 。 原代培养乳腺上皮细胞广泛应用于研究泌乳刺激素和生长激素的分子机制，基质在细胞分化、增殖过程中的作用，致病菌及其产物与乳腺上皮细胞的相互作用。 原代细胞不是单纯的只有一种上皮细胞 ，它还包括 一些间叶组织的细胞 （ 一般不超过 10%） 。尽管在体内 这些 环绕上皮细胞周围的细胞对上皮细胞是有利的，但在体外培养中被看作是一种污中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 4 染。针对在培养过程中出现的成纤维细胞的问题可以通过梯度离心和添加 or 法净化。（ ， 1995； ， 1990）。 原代培养的细胞经过遗传变异丢掉一些原始的受限制的特性 ， 只有少部分能够在体外的条件下生存。经过多次传代的原代细胞导致它们的生 长率、乳汁合成、对泌乳刺激素和生长因子的敏感性和体内的细胞产生很大的变异。这个问题可以通过低温贮藏新鲜分离的细胞来解决。 在不丢失原代细胞的生存能力、合成特有的脂肪酸、乳蛋白的前提下对原代细胞的冷冻解冻 技术已经被成功的研究运用（ ， 1996）。 目前常用的 分离乳腺上皮细胞的方法 主要包括两种，一种为 组织移植法 ， 用这种方法可以分离获得大量的细胞冻存用于一系列的实验 。另一种方法是 酶消化法， 即用胰酶、胶原酶、透明质酸酶、消化 ， 然后离心、过滤、梯度离心分离细胞和腺泡碎片。 用这种方法得到的细胞生长力和生命力比 较低（ ， 1996）。 各种不同的基质被开发应用于体外上皮细胞的特殊目的的研究。铺有胶原的细胞培养方式有利于研究细胞的生长和贴壁情况，然而漂浮的 利于研究细胞的分化和乳蛋白的合成（ 1992）。在体外，一些促细胞分裂剂被证明影响乳腺上皮细胞的增殖。 胰岛素、 胎牛血清、牛垂体、肾脏、子宫、乳腺提取物 等 可以显著的增加牛和绵羊的乳腺上皮细胞原代培养的 合成。 而 牛 绵羊的胎盘催乳素、绵羊泌乳刺激素被证明对原代细胞的生长几乎没有影响（ ， 1982）。 在血清培养条件下， 协同作用。分离培养的绵羊 乳腺上皮细胞 合成 过程，对胰岛素、 ， 1990）。综上所述，可以得出这样一个结论，在体内乳腺上皮细胞有丝分裂的发生依靠乳腺不同生理阶段生长因子的联合调节。 在体内，分化到一定阶段的乳腺上皮细胞表现出不同的细胞形态，细胞的生长率降低，乳汁分泌增加。在泌乳期分离的乳腺上皮细胞在体外能维持合成乳汁的能力（ ， 1994；， 1996）。没有分化的上皮细胞过度后增殖很快，培养到了分化阶段开始表达乳蛋白。体外培养细胞发育和维持分化阶段主要依靠培养条件、培养皿基质、以及激素环境 等 。在体外，胰岛素、泌乳刺激素、氢化可的松被证明是合成乳蛋白的基础（ ， 1994）。在这些激素存在的条件下，从泌乳期分离的乳腺上皮细胞即使生长在塑料的基质上也能分泌酪蛋白，尽管在这些基质上它们看起来只是单层。细胞生长在基质上形成排列紧密的鹅卵石样层面，并有大量的半圆形区域形成。这些细胞乳蛋白的合成水平受基质的浓度和贴壁程度的调控。在 悬浮载体上生长的细胞呈筒形分布，形成多层结构。它们显著的增加酪蛋白和白蛋白的合成，减少乳铁传递蛋白的产生（ ， 1995）。 导形成许多多细胞围成的泡状空腔结构。在这种条件下，细胞的生长显著降低，培养在 细胞和漂浮培养的细胞相比，酪蛋白的表达显著提高。 脂质小滴 存在于原代培养的乳腺上皮细胞 中 。 （ 1987），研究表明新鲜和冷藏的山羊乳腺上皮细胞 有 维持从头合成脂肪酸的特性并把它们合成细胞脂滴。 （ 1989） ，研究表明山羊和牛的乳腺上皮细胞可以利用外源的 游离 脂肪酸通过酯化作用和转化作用生成磷脂。此外，这些试验还证明了 游离 脂肪酸（棕榈酸、油酸、月桂酸）可以改变个别脂肪酸的从头合成以及形成 些处理和给泌乳期的动物添加牛奶脂肪酸的效果相似。所以，原代乳腺上皮细胞可以作为极好的模型在体外研究乳脂的合成。但是，它们维持合成分泌乳脂通过传代和冷藏会收到限制甚至消失。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 5 为了 更多的 研究乳腺上皮细胞的生理学反应，建立接近自然状态的细胞培养体系至关重要。为了研究哺乳期的调节，要包括从同种动物中分离基质和联合培养在体内生长在上皮细胞周围的细胞。原代培养牛肌上皮细 胞已经被成功分离培养 （ ， 1990） 。肌上皮细胞和腺上皮细胞的联合培养可以在塑料基质上形成小的圆顶型结构（ ， 1996）。在培养过程中熟练操纵添加激素生长因子的成分和量，例如在体外模拟在怀孕前期激素的变化，可以促进和调节分化末期的乳腺上皮细胞。 续细胞系 像 其他细胞系一样，建立完善的细胞系是研究乳腺上皮细胞生物学特性的有用工具。然而这一领域的发展却是不完善的。这种情形随着 1991） 的研究有所改善。它们通过 胞系（ 结果表明 留了乳腺上皮细胞的形态特征并且能分化分泌与牛奶相近的产物。在随后的五年里，这种细胞培养模型被广泛的应用于 两个领域的研究：不同生长因子、生长抑制因子在奶牛乳腺上皮细胞生长、分化、的作用以及致病菌和奶牛乳腺上皮细胞的相互作用。 用来证明 奶牛乳腺上皮细胞重要的细胞有丝分裂因子。 （ 1994），在后来的报道中指出 导 表达，是 响促有丝分裂的主要环节。 径中的重要意义近来被 （ 1998）证明。 报道， 过量的 维甲酸 会 抑制 胞的增殖，同时降低 水平， 水平升高。 皮细胞的生长受牛乳 转 铁蛋白、 抑制。用 和 、白细胞介素（ 以有效地抑制乳腺上皮细胞的分化（ ， 1993）。这些 研究 表明 乳腺上皮细胞 的相关产物包括生物活性物质在体外的反馈过程中有重要作用。 （ ， 1995） 的研究也表明 血清和蛋白 的环境下可以产生典型的尿激酶、血浆酶原催化剂、血浆酶原抑制剂（ 和 体，执意现象和乳腺的发育、退化有关。 表达受乳腺激素、生长因子以及各种 调节。 胞系模型 也 存在 着 一定的问题。首先， 是单一的细胞而是包含不同种类的细胞。 有 三种亚克隆 其 大小不一、生长方式和细胞特征都不相同。这些差异是否是身具有的特点，目前的体外永久奶牛乳腺 上皮 细胞还不能弄清楚这些问题。其次，尽管能有影响 乳腺上皮细胞 生长、泌乳的作用（ ， 1990），但是无论