干细胞生物学期末复习.docx

1、 干细胞：干细胞是具有高度自我复制和多向分化潜能的细胞群，即干细胞可以通过分裂来维持自身数量的恒定及其生物学特性，同时又可进一步分化为各种组织细胞，以修复组织损伤，维持机体生理平衡。2、 胚胎干细胞（ES）：源自植入前胚胎的干细胞，具有无限的自我复制能力，能够形成包括生殖细胞在内的所有成体细胞类型。3、 胚胎癌细胞（EC）：一种包含多种分化细胞类型的胚胎性肿瘤中的亚全能性干细胞，其表型类似于胚胎干细胞，但分化能力有限且具有异常核型。4、 胚胎生殖细胞（EG）：一种源自原始生殖细胞的亚全能干细胞。取材自原始生殖嵴。5、 细胞分化：是指细胞获得特异的外观、表型和功能特征的过程。即在分化的过程中，细胞内一些特定的基因开始表达，而其他基因并不表达，从而一个非特化的细胞特化成为一个具有特殊结构并执行一定功能的细胞。6、 干细胞小生境（stem cell niche ）：干细胞的数量、分裂、自我复制和分化可能受到细胞内在因素和周围微环境的外在信号的共同调节，这些周围微环境被称为干细胞小生境。7、 饲养层细胞：指生长能力受到抑制的细胞层，它们能对另外一个细胞群体提供营养、生长因子和基质成分8、 囊胚：发育过程中临近植入的胚胎是一个空腔化的球体。球的外层是滋养层，球的内表面的一端是内细胞团。9、 内细胞团（ICM）：指位于囊胚内表面一端的亚全能细胞团，它植入后发育为胚胎的主体部分。10、 亚全能干细胞：指不具备发育为整个生物体的能力，但能够分化为机体任意一种细胞类型的细胞。11、 成体干细胞：囊胚期之后，胎儿、儿童、成人组织中存在的干细胞统称为成体干细胞。13、自我复制（self-renewal）：干细胞特征性的分裂方式。通过这种分裂至少能够产生一个具有和亲代干细胞同样分化能力的子代细胞。对称性自我复制产生两个干细胞，而非对称性分裂产生一个干细胞和一个分化的后代。在分子水平上，自我复制事件包含防止细胞分化和促进细胞分裂两种机制。14、 干细胞可塑性: 注定产生某一给定组织的干细胞/祖细胞明显获得的产生其他组织分化表型的能力。即当细胞命运指向于某一给定组织后，仍可获得其他组织的分化表型。15、 间充质干细胞：中胚层来源的，遍布间充质及血管周的一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。16、 IPS细胞：借助“逆转录酶病毒”载体,向体细胞中转染多能基因 (Oct4,Sox2,c-myc，Klf4 )，通过基因重排，使体细胞具备类似胚胎干细胞功能。这种被改造过的细胞称作诱导性多能干细胞即IPS细胞。17、 神经球：在使神经干细胞增殖的培养系统中，体外生长的神经祖细胞形成的非黏附的细胞球。18、 神经干细胞（Neural stem cell,NSC）：是神经系统内最原始的细胞。能够自我复制；在多个区域和多个发育阶段中分化形成所有神经细胞谱系的细胞（神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞等）；并能够迁移进入发育中和（或）变性的神经区。19、 gp130：分子量为130kDa的跨膜糖蛋白，是IL-6等细胞因子的共有信号传导链；其胞内域含有三个缺乏内在激酶活性的保守基因序列 ，负责将胞外信号传递到胞内；虽然gp130广泛存在于多种细胞表面，但配体特异的受体分布非常严格，LIFR、OSMR、CNTFR仅在ES细胞表达。 20、 原代培养：也叫初代培养，是指直接从机体取下细胞、组织、器官，置于合适培养基中使之在体外维持与生长。21、 干细胞治疗：干细胞治疗或移植是指应用人类自体、同种异体或异种（非人体）的干细胞经体外操作后回输（或植入）人体的治疗方法。22、 干细胞的增殖分裂方式： 干细胞的分裂实际上是相对不对称分裂。也就是说干细胞有可能分裂成为两个与亲代相同的子代干细胞。或者分裂成一个与亲代细胞相同的子代细胞，另一个成为分化细胞。这种相对不对称分裂的结果就使得子代细胞，一部分成为功能专一的分化细胞，另一部分保持干细胞的特征。23、 干细胞分类：按分化潜能分：全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。按来源分：胚胎干细胞 、成体干细胞、诱导性多能干细胞24、 体外培养细胞发生恶性转化后所具有的特点： 获得无限增殖能力 ；产生致瘤性 ；生长密度依赖性降低 ；贴壁依赖性丧失； 血清依赖性降低。25、 国际细胞疗法学会对间充质干细胞的建议性鉴定标准： 在体外培养中必须具有贴壁性；CD105、CD166、CD73抗原呈阳性表达；CD45、CD34、T细胞和B细胞抗原呈阴性； 标准的体外分化条件下，至少能分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，并且能用普遍接受的染色程序加以证明。此原则是目前MSC培养鉴定的金标准。 26、小鼠胚胎干细胞建系过程：获得延迟着床囊胚 ；脱除胚胎透明带；分离内细胞团（ICM） ；离散内细胞团；接种在饲养层细胞上；培养扩增后传代。27、 获得小鼠延迟着床囊胚过程： 切除怀孕3.5d母鼠的卵巢；使用孕酮阻滞胚胎的着床；使胚胎在子宫中自由漂浮；在延迟着床状态下，胚胎可保持活性达10d；用培养液将胚胎从子宫里面冲出来；按正常囊胚继续处理。28、 间充质干细胞体外多分化潜能鉴定： 向脂肪细胞诱导分化：培养至P3的间充质干细胞更换成脂肪细胞诱导培养液数天后，细胞形态发生改变，胞体变大，胞质内有脂滴聚集；用脂性染料油红O能将脂滴染成红色；RT-PCR证实诱导组表达脂肪细胞分化特异性基因PPAR-。 向成骨细胞诱导分化：培养至P3的间充质干细胞更换成骨细胞诱导液一段时间，细胞形状由梭形变为多角形，细胞集落生长的中央可见透明状矿化结节形成。Von Kossas矿化结节染色呈深棕黑色，茜素红将其染成桔红色。说明在矿化培养后的细胞可以形成细胞外矿化基质，具有成骨细胞表型。RT-PCR检测结果显示诱导组细胞表达成骨细胞诱导分化过程中特异性蛋白骨桥蛋白。向软骨细胞诱导分化：培养至P3的间充质干细胞更换成软骨细胞诱导液后细胞形状由梭形变为铺路石状。细胞爬片经成软骨细胞特异性染料甲苯胺蓝染色，细胞周围有蓝色基质染色。经型胶原免疫荧光染色结果呈阳性。RT-PCR检测结果显示诱导组表达软骨细胞诱导分化过程中特异性蛋白collagen。29、 促进体外培养细胞贴附的措施包被 ：对分化程度高、生长能力差的细胞可在培养皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质 如:纤连蛋白、胶原；减少接种时细胞悬液的量，待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液；培养液中离子成分及其浓度：如Ca含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展；培养液的温度：低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁。30、 神经干细胞对神经损伤的修复机制： 产生外源性神经元，与神经系统整合形成新的神经突触，重建神经元回路；产生胶质细胞，促进新生的神经纤维和残存脱髓鞘的神经纤维髓鞘化；替代受损星形胶质细胞以提供营养和保护；分泌神经因子，营养支持神经元；免疫抑制作用，抑制未受损神经细胞免遭炎性细胞攻击。31、iPS发现过程中Fbx15干细胞筛选体系的建立通过同源重组技术在小鼠Fbx15基因处插入一段geo基因（-牛乳糖及新霉素抗性基因的融合基因）由于Fbx15只在胚胎干细胞表达，Fbx15 promoter（启动子）操控的抗药基因在成体的成纤维细胞里不表达，所以细胞对药物 G418敏感；如果终末分化的成纤维细胞能诱导成胚胎干细胞，那么它就会产生对 G418的 抗药性。即便成纤维细胞只是获得了部分胚胎干细胞的特性，那么它也应该能抗低浓度的 G418。将24种与细胞多能性相关的基因通过逆转录病毒全部转入Fbx15geo/geo小鼠的成纤维细胞内并将被转染细胞在含G418的ES培养基上培养，少量存活细胞呈现出ES的近似形态及ES的近似细胞周期。32、细胞原代培养的组织块培养法的具体过程。原代培养:是指直接从机体取下细胞、组织、 器官 ， 将其放置在合适的培养基中，使之在体外维持与生长。胎鼠饲养层细胞原代培养为例，原代培养组织块培养法具体过程是：（1）将孕鼠拉颈椎致死，消毒。（2）将孕鼠腹部剪开，露出子宫，分离子宫系膜，将子宫取出，PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。（3）剪开子宫，取出胎鼠，用PBS洗涤3次（4）去除胎鼠头部、内脏。将躯干部用PBS洗涤3次,充分去除红细胞。（5）剪成小块（1mm3），再用PBS液清冼。（6）将组织块转移到培养瓶，贴附在瓶底面。各组织小块之间距离0.5cm为适宜。（7）翻转瓶底朝上，加适量培养液勿接触组织块。37静置3-5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中。37继续培养。几天后细胞就会从组织块周围爬出来。当细胞逐渐长满培养瓶底面时即可进行传代培养。 33、小鼠胚胎干细胞进行鉴定鉴定的方法有：形态学、核型、特异性标志物、分化潜能等。形态：小鼠ES胞体小,核大,核中有一个或几个明显核仁；在体外分化抑制培养中呈克隆状生长，形似鸟巢。核型：具有稳定的二倍体核型特异性标志物： Oct-4 ： 碱性磷酸酶(AKP) 、SSEA-1。分化潜能检测(1)体外分化鉴定 ：在培养过程中部分细胞聚集贴壁,培养一段时间后将分化为神经、肌肉、软骨等不同组织的细胞。 再按组织特异性染色进行鉴定。(2)体内分化鉴定：将ES细胞注入基因型相同或免疫缺陷动物皮下。如该细胞为ES细胞,可形成包括3个胚层细胞的畸胎瘤。常规制作切片观察。(3)嵌合体形成：将ES细胞注射到不同品系小鼠囊胚内形成嵌合体。嵌合体动物的各种组织器官是由供者Es细胞和受者的胚泡共同发育而来的。这是检测一个细胞系是否为ES细胞系的金标准。嵌合体动物可以通过毛色、皮肤色素等进行判断。 34、神经干细胞鉴定 （1）自我更新能力鉴定：为证实细胞是否具有自我更新能力，可对神经干细胞进行5溴尿嘧啶掺入实验。5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的同源替代物，可以在细胞周期的S期掺入到细胞核DNA内，如果神经干细胞在丝裂原刺激下能够进行增殖，就会将5溴尿嘧啶整合入细胞DNA。DNA链只要有0.5%胸腺嘧啶被5溴尿嘧啶取代，就可以利用5溴尿嘧啶单抗标记技术检测出来。5溴尿嘧啶阳性的细胞就是增殖细胞。（2）特异性抗原nestin检测：免疫细胞化学染色法（3）多向分化潜能检测: 神经元检测：神经元突起细长，单极或双极。神经元特异性抗原标志常用的有NSE、NeuN、微管相关蛋白。星形胶质细胞：星形胶质细胞体积较大，细胞突起数目多，而粗大。特异性抗原为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。少突胶质细胞：体积小，细胞突起较少，且短细。常用检测的特异性抗原标志CNPase。35、胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化产生大量分化细胞类型最有效的方法是通过拟胚体（embryoid body,EB）系统。所有的人类ES和大多数小鼠ES需要ES首先聚集成EB以提高分化效率。 （1）分散ES ：加入0.25%胰酶0.04%EDTA，当克隆边缘回缩、逐渐变圆、细胞从培养板上的MEF层上卷起时加入FBS终止消化；用细胞刮刮培养板底部并吹打克隆，形成均匀的细胞悬液；离心，用10ml分化培养基重悬细胞；将细胞悬液接种预先以明胶铺底的培养瓶，37,5%CO2条件下1h，以使悬液中成纤维细胞贴壁，收集未贴附细胞；离心，以1ml分化培养基重悬细胞并吹打至均匀 (2)制备悬滴 分化培养基将细胞稀释为400500个/30ul；培养皿盖子设置移液指南（间距8mm横竖交叉线的交叉点即为放置液滴的点；培养皿盖子内表面交叉点放置30ul细胞悬液液滴；培养皿内加入10mlPBS；翻转培养皿盖子，盖在培养皿上；放入培养箱培养形成EB (3)向心肌分化：将EB转移至24孔培养板， 加入成心肌细胞诱导培养基；放入培养箱，3d换液。每天监测出现搏动区域。36、NSC增殖与分化相关NF-B信号通路NF-B是一种转录因子。未激活的NF-B与其抑制因