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小RNA测序的一些可选的生物信息分析内容一、Small RNA深度测序分析分子RNA（Small RNA）是生命活动的一类重要调控因子，长约1040nt，广泛存在于从低等的病毒、线虫、植物到高等的动物机体中。主要包括微RNA(miRNA)、小干扰RNA（siRNA）、与piwi相互作用的RNA（piRNA）三类，它们通过包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成等多种途径，在生物体基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等过程中发挥着重要作用。Small RNA结合Illumina HiSeq2500/MiSeq新一代测序平台，一次性可获得数百万条sRNA序列，通过生物信息方法，可以在全基因组水平快速鉴定和预测各种类型的Small RNA，得到其可能调控的基因的功能，为Small RNA功能及其对基因调控机制的研究提供了有力工具。目前，提供150bp读长，HiSeq2500、MiSeq两种测序平台的Small RNA测序和信息分析服务。技术优势精确度高：可以检测出sRNA单个碱基的差异；灵敏度高：可以检测出组织中几个到几万个拷贝的sRNA；价格低廉：一次可产出上百万条序列；样品起始量低：使用NEB原装small RNA建库试剂盒及配套试剂，样品起始量低至3ug；既可以鉴定已知的sRNA，又能够发现新的sRNA。生物信息分析内容标准信息分析内容及流程：图1Small RNA标准生物信息分析流程图此外，Small RNA还有如下可选分析内容：更多定制化分析内容，可以根据您的科研需求量身定制。项目流程诺禾致源严格的样品检测流程，规范化的建库操作，高稳定的测序平台为您的项目获得高质量的数据提供了有力的保证。HiSeq 2000项目周期45天，MiSeq测序项目周期14天。图2HiSeq/MiSeq Small RNA项目流程图建库测序流程诺禾致源使用NEB针对Illumina测序平台研发的Small RNA建库试剂盒（NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina）及配套的原装进口试剂，只需切胶一次，避免了反复切胶造成的Small RNA信息丢失，大大减少了所需的样品量。图3Small RNA建库流程图二、mRNA与microRNA联合分析microRNA对靶基因的表达具有负调控作用。mRNA与microRNA联合分析是基于将成对样品分别进行Small RNA，转录组或数字基因表达谱（DGE）测序后，在标准信息分析基础上，对差异microRNA及其对应靶基因进行联合分析。利用两者数据贯穿分析，可有效提升数据利用率，提高Small RNA 靶基因预测准确性，结合差异表达microRNA和差异表达mRNA的互作关系，能够得到多个microRNA与多个基因的调控关系网络。microRNA与mRNA关联分析，可以广泛的应用于动植物的生长发育、基因调控机理、代谢及疾病的发生等领域。技术优势数据利用率高：有效提升数据利用率，充分挖掘mRNA和Small RNA的数据信息；无需二次测序：可直接利用mRNA和Small RNA的数据进行关联分析；优质技术服务：针对客户研究物种和目的，提供方案设计。联合分析内容案例解析案例一心脏结构特异转录组数据表明miRNA-mRNA之间存在保守的相互作用（Vacchi-Suzzi C, et al. 2013）研究背景miRNA在基因表达的转录后水平调控中发挥重要作用，对心脏发育及心血管疾病的产生有重要影响。研究方法本研究对鼠、比格猎犬和食蟹猴三个物种心脏的8个不同组织分别进行小分子RNA测序，通过表达水平上的负相关性和靶基因预测找出与心脏功能相关的miRNA-mRNA之间的互作关系。研究结果1、在三个物种中的心脏瓣膜和心肌中各鉴定出了9个和7个保守miRNA被富集。用原位杂交的方法也同时验证了心肌中富集的miR-1和心脏瓣膜富集的miR-125b-5p和miR-204的组织特异性富集。2、通过表达水平上的负相关性和靶基因预测的方法鉴定出miR-1/Timp3、miR-125b/Rbm24、miR-204/Tgfbr2和miR-208b/Csnk2a2之间的miRNA/mRNA互作关系（图1），miRNA与其靶基因呈负相关。3、通过测序数据分析构建了三个物种中的心脏结构特异的miRNA/mRNA表达数据集，为miRNA调节通路在心脏分子生理病理学研究提供了比较全面的数据。图4数据分析表明在不同组织中miRNA与其靶基因表达水平呈负相关实验流程图参考文献1. Vacchi-Suzzi C, et al. Heart Structure-Specific Transcriptomic Atlas Reveals Conserved microRNA-mRNA Interactions. PLoS ONE, 2013, 8(1): e52442. doi:10.1371/journal.pone. e52442.三、病毒siRNA鉴定近年来，越来越多的研究结果证实高通量Small RNA测序可以用于鉴定寄主中未知的病毒、类病毒（Maijuan M, 2011，Wu Q, 2012）。原因是病毒Small RNA分子相互重叠，使重叠群能够组装病毒基因组序列。高通量Small RNA测序技术为病毒快速鉴定提供了一种不需要分离培养、富集病毒的方法，大大缩短了鉴定周期。可广泛应用于虫媒传染病的病原体监控和动植物病毒鉴定、检测和全基因组测序等领域。技术优势取样方便：无需离体培养病毒，直接提取感染病毒组织的total RNA；无需参考基因组：在寄主没有参考基因组的情况下仍可对病毒进行鉴定；准确可靠：实验验证率达80%以上。信息分析流程图5 病毒鉴定项目信息分析流程图分析内容siRNA拼接组装；与病毒数据库的比对注释，候选病毒筛选；候选病毒库的评估。项目流程案例解析案例一不依赖序列相似性，通过深度测序和一种新算法来发现环状RNA类病毒（Wu Q, et al. 2012）研究背景类病毒是一类只感染某些植物的单链闭合环状、不编码蛋白的RNA分子。类病毒利用寄主的RNA聚合酶，通过一种滚动循环机制产生多次头对尾重复的中间体来进行复制。在很多真核寄主中，由病毒引起的小干扰RNAs（siRNAs）是一种抗病毒免疫反应，这些由病毒引起的siRNA通过RNA干扰（RNAi）或RNA沉默来特异的清除病毒RNA。病毒衍生的siRNA和的piRNA序列有重叠，因此有可能将它们组装成更长的片段来进一步组装获得病毒的基因组。研究方法本研究通过对被PLMVd感染的桃树和被HSVd、GYSVd感染的葡萄藤卷须的Small RNA文库数据进行分析，发明了一种鉴定环状RNA类病毒的新算法PFOR，用它从葡萄藤卷须Small RNA文库中鉴定出一种新的环状RNA类病毒GHVd，然后通过实验证明了PFOR可以预测获得新的类病毒98%的序列，在意大利和加利福尼亚葡萄藤中均有GHVd类病毒，且序列相似度高达99%。研究结果1、用软件Velvet和Vcake能够将文库中的类病毒组装成各种长度的contigs，且类病毒的sRNA序列有重叠，但用这2个软件将这些contigs与已知的类病毒进行相似性比对，没能发现新的类病毒；2、发明了一种发现类病毒的新算法PFOR。通过对两种植物被侵染组织的Small RNA进行组装，证明了PFOR能够快速的富集类病毒产生的siRNA，并组装获得类病毒的全长；3、从葡萄藤中鉴定出一种锤状类病毒GHVd。通过RT-PCR，证明PFOR能够预测出GHVd序列全长的98%；4、实验证明GHVd类病毒RNA的锤状核糖酶具有酶活性；5、通过Northern杂交和RT-PCR在意大利和加利福尼亚葡萄藤中均检测到类病毒GHVd，序列相似度高达99%。图6 375nt的环形类病毒GHVd的RNA二级结构预测和RT-PCR、Northern blot检测结果参考文献1. Maijuan M, et al. Discovery of DNA viruses in wild-caught mosquitoes using Small RNA high throughput sequencing. PLoS ONE. 2011; 6(9):e24758. doi: 10.1371/journal.pone.