【毕业学位论文】（Word原稿）高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究植物病理学博士论文

密级：无 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建 及杀虫晶体蛋白的研究 F 中国农业科学院博士学位论文 摘要 摘 要 苏云金芽孢杆菌（ 目前世界上应用范围最广的杀虫微生物，但是传统的 株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，因此必须通过生物技术手段构建高效广谱的 程菌来满足生产的需要。苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋白结构和作用机制是目前国内外研究的一 个热点；在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上，可以通过分子设计来改变杀虫晶体蛋白的毒力和杀虫谱，为转基因植物或微生物提供新的基因来源。 本论文围绕苏云金芽孢杆菌工程菌的构建、杀虫晶体蛋白的分子设计、杀虫晶体蛋白的体外结晶等方面进行了一系列的研究，主要内容包括： 将对鞘翅目害虫高毒力的 因分别通过电击转化到对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株 ，得到工程菌 内生测结果表明两株工程菌对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫都表现出很高的毒力，其中 鞘翅目害虫榆蓝叶甲 和马铃薯甲虫的 别为 mg/mg/鳞翅目害虫甜菜夜蛾和小菜蛾的 别为 g/g/榆蓝叶甲和马铃薯甲虫的 别为 mg/mg/小菜蛾的 g/程菌在田间对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫也表现出了很好的防效。在用量为40 g/亩时， 甜菜夜蛾的防效达 在使用浓度为 1g/L 时， 马铃薯甲虫的防治效果为 接近化学农药的防治水平，具有良好的开发和应用前景。 通过监测工程菌在田间的残留、扩散以及对非靶标昆虫的影响，完成了工程菌中间试验和环境释放阶段的安全性评价。评价结果表明工程菌 田间存活时间较短，扩散范围较小，对草蛉、瓢虫等非靶标昆虫种群无不良影响。因此认为这两种工程菌使用安全， 对于生态环境不会造成有害影响。 为了确定 最小活性区，通过 增获得 9 种不同长度的 因片段，分别在大肠杆菌 表达。采用浸叶法测定了相应蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性，最 终将白对小菜蛾的最小活性区确定在第 22氨基酸之间。 通过重叠引物 到由 白 分别与 大肠杆菌 进行表达；提取三种蛋白，对棉铃虫和甜菜夜蛾进行了杀虫毒力测定。结果表明，与 白相比，三种嵌合蛋白对对棉铃虫的毒力力有不同程度的提高，但对甜菜夜蛾的毒力都有所降低。 通过高效液相色谱纯化了对小菜蛾高毒 力的 白以及对甜菜夜蛾高毒力的营养期杀虫蛋白 用气相扩散法，探索了两种蛋白体外结晶的条件，最终分别得到了方形的白晶体和正八面体形的 白晶体。这些结果将为这两种蛋白的结构与功能解析奠定了基础。 关键词：苏云金芽孢杆菌工程菌，杀虫晶体蛋白，营养期杀虫蛋白，蛋白结晶，嵌合蛋白 中国农业科学院博士学位论文 摘要 is of t as as to is by A 03 to by 033A in 033A to g/g/mg/(mg/ . P. . g/mg/ml mg/ml . . 033A 033A . 00 g/033A . at g/L. 033A is of 033A in t in on of t a of 0 of t no To of . 2 55, is in In to of by To of II to of +II II of to . of II be a to of 中国农业科学院博士学位论文 摘要 中国农业科学院博士学位论文 目录 i 目 录 绪 论 . 1 1 苏云金芽孢杆菌 . 1 虫 毒素 . 2 虫蛋白与其它物质间的增效 . 15 2 杀虫蛋白的应用 . 16 虫基因植物 . 16 基因微生物 . 17 3 转基因生物的安全性 . 19 4 本研究的立题依据 . 21 5 本研究的 目的和意义 . 21 第一章 对鳞翅目和鞘翅目害虫高毒力工程菌的构建 . 22 1 材料与方法 . 22 验材料 . 22 究方法 . 24 2 结果与分析 . 30 体 构建 . 30 组质粒 构建 . 31 程菌 构建和验证 . 31 程菌 生长特性 . 34 程菌的遗传稳定性 . 35 程菌的发酵 . 35 程菌的生物活性测定 . 35 3 讨论 . 40 4 小结 . 41 第二章 工程菌 生物安全性评价 . 43 1 材料与方法 . 43 验材料 . 43 究方法 . 43 2 结果与分析 . 45 程菌的残留分析 . 45 程菌的扩散分析 . 50 程菌对其它非靶标昆虫的影响 . 51 3 讨论 . 53 4 小结 . 53 第三章 杀虫晶体蛋白 小活性区的测定 . 54 中国农业科学院博士学位论文 目录 材料和方法 . 54 验材料 . 54 究方法 . 55 2 结果和分析 . 56 列分析结果 . 56 物设计 . 57 同 因片段的克隆和 检测 . 57 同 因片段的表达 . 58 同 白片段的生物活性测定 . 59 3 讨论 . 60 4 小结 . 62 第四章 杀虫晶体蛋白 性区的体外结晶 . 63 1 材料与方法 . 63 验材料 . 63 究方法 . 64 2 结果与分析 . 70 因片段的重组质粒的构建 . 70 白的诱导表达 . 71 白对小菜蛾的生物活性 . 72 白的分离纯化 . 72 白结晶 . 73 3 讨论 . 74 4 小结 . 75 第五章 营养期杀虫蛋白 纯化与体外结晶 . 76 1 材料与方法 . 76 验材料 . 76 究方法 . 77 2 结果与分析 . 78 t 因的扩增和克隆 . 78 2.2 因的序列分析 . 79 2.3 因的诱导表达 . 80 白对甜菜夜蛾的生物活性测定 . 81 白的分离纯化 . 81 白结晶 . 81 3 讨论 . 83 4 小结 . 83 第六章 杀虫晶体蛋白的分子设计 . 84 1 材料和方法 . 84 中国农业科学院博士学位论文 目录 验材料 . 84 究方法 . 85 2 结果与分析 . 87 同杀虫晶体蛋白的序列分析 . 87 物设计 . 87 合基因的构建 . 87 组表达质粒的构建和检测 . 89 合蛋白的诱导表达和 测 . 89 物活性测定 . 89 3 讨论 . 90 4 小结 . 91 第七章 结 论 . 92 参考文献 . 93 致 谢 . 106 作者简历 . 108 中国农业科学院博士学位论文 插图和附表 图和附表 绪 论 表 1 我国分离克隆的 Bt 因 4 表 2 杀虫晶 体蛋白结构比对结果 5 表 3 营养期杀虫蛋白的种类 12 表 4 杀虫作用特征 13 图 1 苏云金芽孢杆菌中的芽孢和晶体 1 图 2 白的三个结构域 5 图 3 三维结构 6 图 4 双元毒素的结构 6 图 5 白氨基酸序列的保守区 8 第一章 表 1株与质粒 23 表 1程菌中 粒的遗传稳定性 35 表 1033A 和 室内对榆蓝叶甲的杀虫活性 36 表 1程菌对马铃薯甲虫的生测结果 36 表 1程菌对椰心叶甲的生测结果 37 表 1033A 和 室内对小菜蛾的杀虫活性 37 表 1程菌株在室内对甜菜夜蛾的杀虫活性 37 表 1程菌对棉铃虫的生测结果 （ 38 表 1程菌田间对甜菜夜蛾的杀虫活性（ 38 表 1程菌田间对甜菜夜蛾的杀虫活性（ 39 表 1程菌田间对马铃薯 甲虫的防治效果 39 表 1黄条跳甲的防效 40 图 1体质粒 建的物理图谱 25 图 1体质粒 建的物理图谱 26 图 1组质粒 工程菌的构建技术路线 27 图 1-4 粒及酶切分析图谱 30 图 1-5 粒及酶切分析图谱 31 图 1-6 粒及酶 切分析图谱 31 图 1033A、 因的 定 32 图 1源于 粒酶切图谱 32 图 1程菌株中表达蛋白的 测结果 32 图 1同时 间 因的表达情况 33 图 1同