【毕业学位论文】（Word原稿）胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素的结构与功能分析及其突变体的研究预防兽医学博士论文

I 密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学 位 论 文 胸膜肺炎放线杆菌 素的结构与功能分析及其突变体的研究 on on 文摘要 猪传染性胸膜肺炎（ 是由胸膜肺炎放线杆菌（ 起的猪的 一种 呼吸道疾病。 素。 为了进一步了解该毒素的结构与功能的关系以及为拓展重组毒素蛋白的应用奠定坚实的理论基础， 本实验以 清 7 型的一株现地分离株 为研究对象， 利用原核表达载体 素的结构基因 达产物都以包涵体形式存在。包涵体蛋白 经过 洗涤、变性、复性和纯化 后 ，使重组蛋白在体外氧化重折叠并恢复到了天然蛋白状态。通过未活化蛋白以及活化后蛋白的溶血试验，证实了活化基因 产物对 素溶血活性是必需的。此外，本试验还以 疫动物，分析了 A 的免疫原性以及对同型菌株 (清 7 型 )和异型菌株(清 1 型 4074 株 )攻击的免疫保护情况。结果表明， 为抗原成分添加到灭活苗中后可以提高灭活苗的免疫效果，不但可以提供完全的同型保护，而且对异型菌的攻击也具有一定保护作用。 自从 1986 年第一个基因缺失的基因工程疫苗在美国批准上市以来，基因缺失技术已成为研究病原微生物毒力基因结构与功能的关系以及构建减毒突变株的一个有效和实用的实验手段，目前已应用到许多种致病微生物的研究工作中 。正是在这一时代背景下， 开展了基因缺失和分子致弱的相关研究。 虽然在这方面国外已经取得了很多进展，但国内关于 子致弱的研究基础还很薄弱，所以在这方面作一些有益的探索将有助于缩小我国与其它国家的差距。 本试验以清 7 型 的 因为研究对象， 把含有 后在体外构建 C 基因的精确缺失并在缺失位点插入 建用于突变 C 基因的转移载体 把该载体用电转化法转入 生型菌株中，使 色体上的同源片段发生同源重组，这样，C 基因完全被 而达到将 了获得最大的电转化效率和重组效率，用 梭载体 受态细胞进行了预转化。在试验了不同组合的电转化参数并对转化条件进行优化后 发现，当电转化参数为：电压 2500v、电阻 400、电容 25f 、转化体系 200l、脉冲长度达 右并进行两次脉冲时，可使 得最大转化效 率，此时的转化子数为 138。利用 清 7 型 获得的转化子数目明显低于国外报道的同型菌株的转化子数。由此我们得出结论认为， 清 7型 关键词：胸膜肺炎放线杆菌， 素，结构，功能， 突变体 is a PP is In to be by a 25-4 PP , to of px we A is to C. be of be by of A be of C is to be in to of A, we A by 4074). A is a it be It by by to be 986, of a in of of of it is a to an to of it in a of by it is or no it A on do to on PP a CR in by to PP on on be As a be on In to we PP of of we of by we PP is a to of to 录 第一章 引 言 . 1 1 . 1 . 1 . 5 . 6 . 7 2 . 8 穿梭载体 . 9 自杀载体 . 10 . 11 本研究的主要内容和意义 . 11 第二章 素的结构与功能分析 . 13 1 材料和方法 . 13 菌株和质粒 . 13 试剂及仪器 . 14 . 14 . 15 . 16 的制备、洗涤和溶解 . 16 . 16 . 17 活化及未活 化 . 18 . 18 素的动物实验 . 18 2 结果 . 19 . 19 . 32 . 33 . 34 . 35 活 化及未活化 . 35 . 36 . 36 . 37 3 讨论 . 41 . 41 溶血活性的影响 . 44 V . 46 . 48 第三章 分子致弱 . 50 1 材料和方法 . 50 株和质粒 . 50 试剂及仪器 . 50 . 51 移重组质粒的构建 . 51 备及纯化 . 53 . 54 电转化 . 54 . 57 2 结果 . 59 . 59 . 59 移重组质粒的构建 . 60 梭载体 预转化 . 61 . 63 3 讨论 . 64 为什么要插入 . 64 影响同源重组效率的因素 . 64 影响电转化效率的因素 . 66 没有筛选到突变株的可能原因 . 71 今后解决办 法 . 73 第四章 结论 . 75 参考文献 . 76 致 谢 . 84 作者简历 . 85 附 图 .国农业科学院博士学位论文 引 言 1 第一章 引 言 1 素 猪传染性胸膜肺炎（ 是由胸膜肺炎放线杆菌 （ 起的 一种严重的猪 呼吸道疾病 。其典型的病理特征是肺脏的出血、坏死以及 与 胸膜 发生 纤维素性粘连。该病是世界范围内的多发病、常见病，给养猪业带来了严重的经济损失。 为 胸膜肺炎的病原菌， 一个最主要的毒力因子是其分泌到 菌 细胞外的外毒素。通过结构基因序列分析和免疫血清学的研究，把 in 素家族， 素是一群可以 使 靶细胞膜形成孔的蛋白毒素，常见于一些病原性的 大肠杆菌的 溶血素 et 1985)，百日咳波特氏杆 菌的双功能腺苷酸环化酶溶血素et 1988)，溶血巴氏杆菌的白细胞毒素 Lo et 1987)和放线共生放线杆菌毒素 et 1989) 以及脑膜炎奈瑟 氏 球菌的两个铁调控外分泌蛋白毒素 et 1994） 。 毒素，包括 et 1991； et 1993,1994； et 1994； 994)。最近又报道发现了一个新的 素 据称其只在体内表达(999)。 在前三种毒素中， 有溶血活性和细胞毒性作用， 血活性强于 有细胞毒性作用。没有任何一种血清型 同时产生这三种 多数只产生两种，如血清型 1、 5、 9、 11 产生 血清型 2、 3、 4、 6、 8产生 数血清型 菌 只产生一种 素，如血清型 10 只产生 清型 7、12 只产生 然有证据显示某些血清型 菌 的毒力要强于其它血清型，但所有血清型 可以产生相同的疾病，这些差别至少在某种程度上与产生不同组合的 素有关，例如毒力最强的血清型既可以产生 可以产生 正因为毒素至关重要， 素的研究成为世界学者关注的重点。 素的分子结构 如果要产生和分泌具有 生物活性的 素，需要相邻的按一定顺序排列的四个基因四个基因位于同一个操纵子内。 因编码毒素的结构蛋白， 因编码活化蛋白，其作用类似乙酰转移酶，参与毒素 A 翻译后的修饰，使之具有生物学活性。 型分泌功能的膜相关蛋白。另外还有一个 因位于操纵子中国农业科学院博士学位论文 引 言 2 之外，主要负责 素从细菌细胞的输出。 素的不同成员具有明显的氨基酸同源性和共同的结构特征： N 端疏水结构域负责 在靶细胞膜上 形成 孔道 和跨膜区， C 端有 一连串九肽序列 (复区，富含甘氨酸（ 天门冬氨酸（ 个结构域在不同的 素中串连重复 8 26 次。甘氨酸丰富的重复序列在其它 素中已被证实对高效结合 很重要的，在保证最大溶血活性所需要的平方面具有重要作用。在 缺失这样的重复序列可以导致结合能力下降以及溶血活性的丧失，但其溶血活性可以通过添加相对高浓度的 得以部分恢复。所以可以据此推断该结构域 与 合，是 素发挥溶血活性所必需的。 C 端还有一个结构域，负责结合 泌信号，在 N 端和 C 端之间，是强亲和毒素的活性位点，在 素中高度保守。 一种强溶血 活性和 强细胞毒 性 的 蛋白， 分子量为 105原来的 、 5、 9、 10和 11以及 et 1994)。 它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞具有很强的细胞毒性作用。 纵子包含四个基因：活化基因 构毒素基因 两个分泌必需基因 些基因以前在血清 型 1 中分别命名为 在血清 9 型中称为 个分泌必需基因 别与 对应。有证据显示， 合成受培养基中游离的 度的调节，在 度高的培养基中，以 主要转录本的 纵子的数量显著高于度低的培养基，总 以 探针的杂交结果显示，前者 杂交强度比后者高 10 倍。与此相比，不论有否 杂交强度都是一致的。 这种调节作用是通过改变 转录水平以及 稳定性来实现的。在 间有不依赖 因子的转录终止信号，由一个 19 5干环结构以及富含 U 的延伸序列组成。该转录信号负责终止 一个短的转录本，只包含 导，大小为 主要地位；另外一个终止信号位于 止密码子下游 106， 含有一个24 4干环结构，可能是整个 纵子的转录终止信号，转录本大小为 含整个操纵子 由 导。血清型 2、 4、 6、 7、 8、 12 没有 此这些血清型不能产生 反，这些血清型拥有一个截短的 纵子，包含 结构基因 3末端。这个不完整的 纵子可能是通过缺失 大部分 形成的。血清 3 型参考株缺少整个 操纵子，所以不能产生和分泌 过对结构基因 实 大肠杆菌 有最高的同源性，其次是 源性最高的区域为三个疏水区以及富含甘氨酸的重复区，这两个区域都是 素的典型特征。有趣的是，尽管先前曾在 用 使 以分泌，但这两个分子的 C 末端的同源性却较小（在其它 素中，结构基因的 3端负责编码分泌信号）。 照不同 素的活化基因进行比较，也得到了类似结果。有一种有趣的现象应值得 我们注意，所有 清型的参考菌株中都不会同时含有 因。不同菌种间分泌蛋白 B 和 D 的同源性显著高于活化蛋白和结构蛋白，这在 素中是很典型的。 C 末端富含 13 个甘氨酸重复序列，可以高效 结中国农业科学院博士学位论文 引 言 3 合 所以其溶血活性不需很高浓度的 性 以及弱细胞毒 性 的蛋白，即原来的 子量为 103过单克隆抗体证实，除血清型 10 以外，所有血清型 的 能产生这种毒素， 能产生此毒素 （ et 1989; et 。根据 明从血清 5 型首先克隆出编码 化蛋白和结构蛋白的基因，对它们进行了测序并分别命名为 序列与血清 9型的 来证实 同一种蛋白。 纵子仅包含活化基因 结构蛋白基因 有分泌蛋白基因 两个分泌蛋白基因很可能在进化过程中被删 除掉，因为在 操纵子中保留有 部分 3末端以及完整的 于与 度同源以及功能相近，所以最终被删除掉。血清 3 型参考株缺少整个 操纵子，没有 以与其它血清型相比，分泌的 通过对 列进行分析， 推测 白 的 分子量为 C 末端含有 8 个富含甘氨酸的重复序列，也许是因为 甘氨酸的重复数较少，所以需要高浓度的 才能达到最 大溶血活性。与 比， 表达不受培养基中 调节。从血清7 型克隆的 因，最初分别命名为 过 列分析，证实它们与血清 5 型和 9 型的 因具有很高的同源性，说明 因在各个血清型中 都 高度保守。 虽没有溶血活性，却有很强的细胞毒性 (et 1991)，以前被称作胸膜毒素分子量为 120最开始称为 通 过在大肠杆菌中克隆和表达 结构蛋白基因 ，发现它存在于血清型 2、 3、 4、 6 和 8 参考菌株中。在以上血清型中，可以找到它的一个完整的操纵子，包括：活化基因 构基因 两个分泌基因 前它们分别被命名为 在己从血清 8 型参考株中获得了 因的 列。 氨基酸序列表明，其具有典型的 素特征，在蛋白 N 末端有 3 个疏水区，在 C 末端部分有 13 个富含甘氨酸的重复区。 虽然没有溶血活性，但与 样，都具有协同溶血活性，即性（ et 1991; 1992; et 1994; et 1995）。 是近年来才发现的 一种 素。 人于 1997 年在 清 1 型菌株 似于脑膜炎奈瑟球菌 因的序列 ， 表明 存在第四种 素基因的可能性。之后， 研究人员分别从 清 1 型 和 3 型 中克中国农业科学院博士学位论文 引 言 4 隆了整个毒素基因并进行了测序和表达，并对表达的产物进行了功能分析，他们将该毒素命名为 et 1999）。 血清 1 型的 的结构蛋白命名为 血清 3 型的结构蛋白命名为 805 个氨基酸，分子量为 202论等电点为 有高度的 同源性，中间的 300 个氨基酸的同源性最高。正如 码 74它的大小与 游的不明功能的 似，但却与它没有高的同源性。 码157 个氨基酸，分子量为 论等电点为 报道的已知蛋白没有任何相似性，包括 质蛋白， 因通常位于 素结构基因的上游。但 佛与 于可见的溶血性和协同溶血表型是必需的。另外， 在 上游，有 105片断，与经典的 启动子序列具有一定的同源性。 是在 末端有一个 825缺失。 522 个氨基酸，分子量为 170 理论等电点为 前 3/4 部分除了 11个氨基酸的差别外，其它部分基本相同，在 100 位氨基酸和 600 位氨基酸之间，是强的疏水区域。必须指出的是， （ , 与 导活化的 et 1994）十分相似。 素蛋白分子的典型结构特征，包括 基化作用位点，以及 C 末端结合 富含甘氨酸的九肽 重复 序列。 末端部分含有 24 个富含甘氨酸的九肽重复序列，在 4 个，两者的组成是相似的，只是 1146 1428 位氨基酸在 之以短肽 A C 末端的结构是不 同寻常的，除了典型的九肽重复外，未知作用的 鲜明序列也被发现在该区域重复，并且与九肽重复一起形成一个模块结构。 当 A 的 全部基因序列或 N 末端以及 C 末端序列与 体连接后在 进行表达时，获得的 和 的部分肽段的产量显著高于表达全部序列所产生的完整的 化的 溶液在 4 以及 保存时是很稳定的，而 以及完整的 A 则存在着降解现象。当 C 末端带有 10签 的 起在 诱导表达时，它所产生的重组蛋白表现出微弱的溶血活性，以及类似于金黄色葡萄球菌鞘磷脂酶（ 的协同溶血作用（ 在这方面与 素最为接近。这些活性需要另外一个基因存在，即 已被证实位于 A 基因之前，与 A 基因协同翻译。重组 白的溶血活性仅出现于生长细胞下面，即把菌落从血平板上移开后才能看到溶血现象，而 用也只出现在生长细胞周围相对狭窄的区域内。这两个事实可能有四方面的原因：（ 1）归因于在 A 分泌活性的缺乏 ，（ 2）归因于额外 基的存在，（ 3）归因于这个大蛋白低的扩散能力，或者说（ 4）归因于以上诸因素的某些共同作用。当 分别表达时，既没有发现 表达的 去了溶血活性和 性，可能是因为在苛刻的纯化条件下（经过 6M 的盐酸胍处理），使蛋白发生了变性。 中国农业科学院博士学位论文 引 言 5 素的致病机制 致肺炎的发病机理的研究始于二十世纪六十年代早期。 致的肺炎损伤的宏观表现是 ，肺脏表面有许多大小不等的炎性区域、出血和坏死。在疾病的早期阶段，炎症反应的特征是出血、中性 粒 细胞浸润、 浆液性和 纤维素性渗出；巨噬细胞浸润以及明显的纤维素性变性只在疾病的晚期阶段出现。在感染的前几个小时，纤维蛋白性渗出、炎性细胞浸润以及出血导致肺泡间隙增厚。肺组织的坏死以及纤维样胸膜粘连是急性反应的后继表现。早期的肺水肿、坏死和微管栓塞与中性细胞的活化有关。在 个小时内，血小板在毛细血管凝集并黏附在内皮细胞上，中性细胞在肺泡间隔内浸润，毛细血管内皮细胞肿胀。在坏死区附近，巨噬细胞增大且数量显著增 加，巨噬细胞摄食中性细胞、血小板以及在肺血管内循环的血纤蛋白。在肺炎病灶区，肺泡和血管内的巨噬细胞都是很丰富的。 感染后存活的动物表现为损伤的完全消退或广泛的、局部的纤维样变性或炎性区肺组织的液化坏死。 大量研究表明 ， 肺炎损伤主要是 菌毒素的作用。用超声 波 处理的细菌培养物和细菌 培养 上清液接种动物能够导致与自然感染相似的病变，这一结果强有力地支持了上述观点。致病性细菌产生的外毒素会导致宿主细胞和组织的损伤或破坏其防御机制，属于细胞孔形成蛋白家族的外毒素 素是许多引起人和动物疾病的革兰氏阴性菌重要的毒 力因子。 素一般具有细胞特异和种特异的溶血性、白细胞毒性和白细胞刺激等作用。 先入侵机体的第一道防线，高浓度的 透破坏细胞质膜，形成孔道，改变 了 膜通透性， 使 细胞外的 入 和细胞内K+流失，细胞内外环境失衡导致细胞裂解。 、 脂质双层膜上形成孔道的能力是不同的。 和 的孔道形成活性相似，也就是说在相同的毒素浓度下形成的孔道数量相当，然而在相同的条件下， 成的单个孔道的传导性却显著低于 ； 成的单孔道传导性与 相似，但其孔道形成活性却至少比 低 10倍。以上结果显示，在这三种毒素中， 与 象，这与两者的 列高度同源以及对绵羊红细胞的溶血能力相似是一致的；而且，两者形成的单孔道的直径也相似，都大约为 小一些，为 三种 有很强的细胞毒性，却没有丝毫溶血活性，尽管 单孔道传导性比 5倍，但两者相同 的孔道形成活性应足以使红细胞膜穿透性增加从而破裂溶解。所以，可以推断，对于红细胞来说，这三种 且这种影响更为强烈，以至于在没有鞘磷脂酶或磷酸脂酶等活化底物协同作用的情况下， 成的孔道并不能导致红细胞溶解。 赖性。 合重复区都是溶细胞所必需的。虽然 素可以溶解红细胞，但它们所具有的白细胞调节活性在致病性中更为重要。微量的 细胞脱颗粒，稍大量的 素能够杀死白细胞，还可以使单核细胞释放白细胞介素 1（ 肿瘤坏死因子（ 加大量的 增强组胺和类花生四烯酸中国农业科学院博士学位论文 引 言 6 的产生，释放这些裂解素，破坏肺泡内皮细胞和上皮细胞的连接，使组织损伤。另外， 素对肺泡巨噬细胞以及中性细胞的强氧化作用，还可以使其释放氧残基，从而表现出对宿主细胞的毒性作用（ et 1994）。 素的免疫原性 “第一代疫苗” 全菌体 灭活苗的免疫效果非常有限，它仅能减轻临床 症状和肺炎的严重程度，减少死亡率，动物会出现亚临床症状和进一步发展为慢性感染。 研究表明，用灭活苗免疫动物，至少需要两次注射才能使动物