【毕业学位论文】（Word原稿）DBS治疗对癫痫大鼠海马电生理及突触外GABA受体分布与表达的影响-癫痫的临床与实验研究神经外科学

分类号： 单位代码： 10752 密 级：公 开 学 号： 2008091 宁夏医科大学 硕士研究生学位论文 of 位 申 请 人： 指导教 师 ： 教授 申请学位门类级 别： 医学 专业名 称 ： 神经外科 研究方 向 ： 癫痫的基础与临床研究 所在学 院 ： 临床学院 论 文 完 成 日 期： 二一一年四月 宁夏医科大学研究生学院 s of s 宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学 关于学位论文使用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学硕士论文 摘要 I 疗对癫痫大鼠海马电生理及突触外 体分布与表达的影响 摘 要 目的 探讨丘脑底核深部脑电刺激 治疗 对海人酸癫痫大鼠模型海马区域电生理模式及突触外 体 亚基分布与表达的影响 。 方法 鼠 24 只，随机分为正常对照组、癫痫组和 疗组，每组 8 只。利用立体定位仪在大鼠海马植入注药套管并在海马及丘脑底核安装记录及刺激电极，在自由状态下经注药套管注射海人酸，建立海人酸癫痫大鼠模型。采用高频电刺激对治疗组大鼠进行 疗，观察动物行为学变化。通过 电信号采集系统记录大鼠癫痫发作及治疗过程中海马区域脑电信号，利用 件对脑电信号进行时域及频域分析，观察 疗对海马电生理模式的影响。 疗 10d 后，取各组大鼠脑组织，经 色观察大鼠海马神经元的变化，同时利用免疫组织化学染色技术检测大鼠脑组织中突触外 体 亚基在癫痫发生时及 疗后的分布与表达。 结果 1. 正常对照组大鼠未见癫痫发作， 疗组大鼠癫痫发作次数（ n=8）明显低于癫痫对照（ n=8）（ 有统计学意义。 疗组大鼠的脑神经元细胞与胶质细胞较癫痫对照组病理损伤较轻，提示 激对神经元具有保护作用。 4. 丘脑底核 加了癫痫大鼠突触外 体 亚基的表达 免疫组织化学染色结果显示，正常对照组 大鼠脑组织突触外 体 亚基主要分布在海马（ n=8）与丘脑腹外侧核（ n=8）（图11A ） 。 癫 痫 组 大 鼠 脑 组 织 海 马 （ n=8 ） 及 丘 脑 腹 外 侧 核（ n=8）突触外 体 亚基表达下降（图 11B）。 疗组的丘脑腹外侧核（ n=8）突触外 体 亚基与正常对照组相比较表达增强（ P海马区（ n=8）突触外 体 亚基表达低于正常对照组（ P是比癫痫组表达增高（ P图 11C）。此结果显示 亚基的表达，同时提高了海马区突触外体 亚基的含量。 宁夏医科大学硕士论文 讨论 13讨 论 多种动物能建立癫痫模型，包括蛙、爬行动物、大鼠、小鼠、免、狗、猫、恒河猴和狒狒等 35,36。海人酸是颞叶癫痫模型制作常用的药物。海人酸模型的制作可通过多种方法实现，主要在于给药方式的不同。海人酸可以通过腹腔，静脉等全身用药，也可以通过立体定向下颅内局部 给药，包括脑室内给药，脑实质注射给药。不同的给药方式尽管各有优缺点，但是都可以成功建立颞叶癫痫模型。由于海人酸的价格较高，购买渠道狭窄，因此和全身用药相比较，局部脑组织注射海人酸是一种较为经济的模型制作方式。 传统的模型制作方式是在动物麻醉的状态下，根据大鼠大脑图谱选定药物注射点坐标，利用立体定向仪确定注射位置，采用微量注射仪局部注射海人酸 37。但是这种模型制作方式有一些难以避免的缺陷，首先，在注射药物时，动物的麻醉会掩盖海人酸注射后的药物效果。海人酸局部脑组织注射时，药物不通过体内代谢直接作用 于海马与临近脑组织。从以往及现在的研究观察，我们发现海人酸的局部注射起效潜伏期非常短，只有不到一分钟的时间，如果利用立体定位仪直接局部注药，此时动物还没有从麻醉中清醒，这样我们很难判断常规方式下急性期海人酸对动物的行为学影响。其次，常规利用立体定位仪注射海人酸时，难以将由急性穿刺造成的创伤因素从实验中排除，尤其当牵扯到脑电信号的采集记录时，这种创伤所造成的干扰是不可忽视的。本研究采用药物注射点预置套管，待动物从手术的创伤中恢复过来，完全清醒自由活动状态下，用脑电信号记录，同时可以通过套管注射药物，这样既可以 观察到药物作用的动物行为变化特点，还可以记录到注药前后的脑电信号，为海人酸癫痫动物模型的电生理研究创造基础。 海人酸癫痫动物模型无论以何种注药途径制作，其临床表现较为相似。根据临床症状可分为急性期 (海人酸注射 2d 内 )、潜伏期 (急性期后 10d 2 月 )和慢性期 (大鼠出现自发性癫痫发作后 )。在海人酸注射急性发作后到反复自发癫痫发作之间的潜伏期差异较大，不同的实验手段和不同的实验室环境甚至相同实验动物分组当中都不相同，从宁夏医科大学硕士论文 讨论 14几天到两月 5 。对照其他研究方式和结果我们发现潜伏期的长短和药物注射方式密切相关，一般全身用药 动物的潜伏期较长，且动物之间的差异较大，而局部用药的潜伏期较短，动物个体之间差异较小。本实验的结果显示动物潜伏期在 3 10d 之间，这是实验中的一个优点。当然，影响动物模型潜伏期长短的因素比较多，我们将在后续实验中探索主要的影响因素。 在本实验中，我们采用镍铬合金漆包线作为电极材料，这种材料较为柔软，尽管在植入时对操作的要求较高，但是其对动物脑组织的创伤较小，是一种理想的电极材料。同时，在电极的植入点周围的颅骨上固定螺丝，使得牙科水泥在凝固时将电极和颅骨紧密牢固固定成为一个整体，在试验中可以避免电极的脱落，此 种实验手段是一种较为合理的方法。 疗的靶点可有多种选择，如丘脑前核、丘脑正中核、尾状核、海马杏仁核、蓝斑和丘脑底核等，不同的靶点都有不同程度的治疗效果 38,39,40,41。对丘脑底核疗的研究发现， 癫痫的治疗具有明显的频率依赖性 42,43。因此，选择丘脑底核作为实验的治疗靶点，主要目的是通过这个相对成熟的治疗手段，来检测其在治疗作用中的远隔效应和生物化学效应。 大脑的电生理影响是多方面的，包括对各种范围的神经元震荡波的影响44。本研究发现，在癫痫动 物模型海马部位，较有意义的脑电信号主要集中在 100此对采集到的脑电信号采用 100通滤波，只分析 100下的部分。根据实际的观察，将频率分为 0 20低频律和 20 100高频率范围，从宏观上比较了大范围频率的变化特征，而更细微的脑电模式改变有待于进一步的研究分析。 实验中癫痫大鼠慢性发作开始时给予 疗，这种治疗有效抑制了癫痫的发作。和癫痫组大鼠相比较，治疗期间治疗组动物癫痫发作次数明显减少。 色结果显示，癫痫组大鼠海马组织神经元坏死和增生同时存在 ，而治疗组海马神经元坏死和增生现象相对较轻（和摘要里的结果一致），表明 疗可以抑制海马神经元坏死增生的发展，但是不能逆转海人酸对海马组织的病理损伤。海马离体电生理研究发现，海马细胞胞体层的癫痫放电的主成份频率为 z 45 。本实验中，在海人酸宁夏医科大学硕士论文 讨论 15注射的急性期，大鼠癫痫发作虽然频率可以达到 400是在最初开始出现异常放电时，海马区脑电信号的主要频率表现为低频范围。随着时间的推移，海马区癫痫发作间期脑电信号的频率增大，但是从波谱能量分布来看，低频范围的脑电信号占优势。癫痫慢性期尖波样 放电的主要频率也集中在低频律范围（ 0 20由此推断，自发放电信号中的低频律信号成分主要来自海马本身，这种频率的能量增加来源于海马形态学病理变化导致的神经兴奋性的增加。可以认为 疗抑制了癫痫的发作，其在海马区表现为 常癫痫波形减少，振幅降低，但是这种治疗并不能改变海马的病理变化和海人酸导致的海马单细胞神经元兴奋性，因此相应海马神经元单细胞 电频率在治疗组和癫痫组没有显著性差异。这也在一定程度上暗示丘脑底核 治疗不仅通过抑制海马放电起到抑制大脑兴奋性的作用，而且可能还通过其他 的神经生物学途径抑制癫痫的发作。 癫痫发作过程中的同步化异常放电可以对大脑造成复杂的影响 46 。在海人酸注射时诱导的癫痫急性发作只是海马局部损伤、兴奋性增高的一个简单表现，这种局部的异常放电可以通过神经连接传播到临近的核团甚至整个大脑，同时表现出相应的行为学特征 47。但是，随着癫痫异常放电对大脑其他部位的影响，使得这些部位的神经元兴奋性增高，在慢性发作期的癫痫发作神经元同步化放电，是一种可能叠加有来自其他核团的同步化异常放电。本实验中对海马区的 号的频率分布分析也正好支持这种解释。 本实验在海马区域检测 现海马神经元的兴奋性在癫痫的发生及发展变化中有其特有的表现。在慢性发作期，海马的单细胞 不能随着癫痫的抑制得到抑制。海马区域的脑电信号 表现可能是大脑整体兴奋性降低在海马区域的一个外在表现。癫痫放电往往是突然发作的，它起始于一个大脑神经元簇的非典型的高同步化放电，随之传播到一个或两个大脑半球上，这使得我们难以判断记录到的脑电信号是单纯海马本身的脑电信号，还是癫痫发作时大脑其他核团的异常放电。本试验的结果显示海马区域神经元兴奋性增高，随着癫痫的发展，海马区 域采集到的信号中高频信号的成分增加，特别是在 疗的过程中，随着治疗对癫痫发作症状的抑制，这宁夏医科大学硕士论文 讨论 16种高频率成分在 疗早期被抑制。结合实验中观察到丘脑腹外侧核在丘脑底核疗中突触外 体 亚基表达增高的结果，暗示这种高频率成分有可能来源于癫痫模型大鼠脑组织其他核团，这也符合癫痫同步化异常放电的特征。当丘脑底核 疗增加丘脑腹外侧核抑制性受体的表达后，丘脑腹外侧核及其附近的大脑核团的兴奋性降低，阻断了大脑癫痫同步化异常放电，使得海马区域记录到的脑电异常放电的频率特征以低频律为主，这也是海马自 身的电生理频率特征。随着丘脑底核疗的进行，这种治疗性刺激对大脑产生更多的抑制，最终表现为治疗后期海马异常放电的数量减少，并且在频率分布上各个频率部分都受到抑制。 本实验中仅仅记录了海马区域一个位点的脑电信号，难以确定异常放电的起源、传播以及最终全脑同步化放电的整个过程，而这个复杂的过程涉及到多个神经核团，同时同一核团不同时相的电生理特征也是不同的，这需要多电极多位点同时记录。随着科技的发展，这种技术手段也逐渐在电生理学的研究中发挥重要作用。 实验中选择的电极直径约 150约可接 触到 15 20 个神经元，这些神经元的数量对于单细胞分析来说稍显太多，但由于癫痫动物模型注射海人酸对海马神经元具有毒性作用，海马神经元有丢失减少，并且随着胶质细胞增生，电极周围的组织相容性作用，电极附近的神经元不会太多。对采集到的信号用 件离线分析，可分离出三种主要的 号，这三种不同波形的信号可看作是电极附近三个或者三类神经元放电。从分离到的信号质量看，本研究的实验方法和实验数据具有一定的科学性和说服力。 本实验对采集到的 行波谱频率分布分析，同时比较 功率谱及 率。这是一种线性分析手段，尽管这种分析手段可以用来在一定的程度上反应脑电信号的差异和变化，但是我们也不能忽视其存在的弊端。由于脑电信号本身具有信号弱，噪声强，频率范围一般较低，随机性强等特点，近年来发展起来的脑电信号非线性动力学方法逐渐得到广泛的应用。对于脑电信号的分析，可应用非线性动力学原理。癫痫的脑电信号 48。我们将在下一步的实验研究中深入探讨这些问题。 本课题结果显示 通过上调突触外 体 亚基这一途径来实现其对宁夏医科大学硕士论文 讨论 17癫痫的抑制作用，同时实验结果显示 激治 疗与突触外 体 亚基存在相关性，这不仅提示 一个治疗作用机制，同时也提示突触外 体 亚基在癫痫发病与治疗中的作用。大鼠海马齿状回突触外 体 亚基的降低与大鼠脑组织病理变化以及行为学相一致，这与国际上普遍的研究结果相一致 21，本实验的研究结果提示，海马在大鼠癫痫发作中起到至关重要的作用。但是我们注意到丘脑腹外侧核中突触外 体 亚基的变化并不与海马齿状回保持一致，在 疗下，丘脑腹后外侧核的突触外 亚基表达上调，此结果表明， 脑腹外侧核 亚基的表达起到治疗癫痫的作用。然而，丘脑底核在癫痫治疗中究竟起什么作用，其与其他相关核团究竟有怎样的相互作用，仍有待于进一步的研究。 宁夏医科大学硕士论文 结论 18结 论 疗可有效抑制癫痫的发作。 2. 疗可以抑制颞叶癫痫模型大鼠海马区异常放电的频率和强度，改变海马电生理放电模式，但是不能改变海马单细胞神经元的兴奋性。 3. 激对神经元具有保护作用，但是不能逆转海人酸对海马组织的病理损伤。 亚基的表达含量 ，起到对癫痫的治疗效果。 宁夏医科大学硕士论文 附图 19附 图 图 1 丘脑底核 疗抑制癫痫大发作的结果 痫对照组慢性期癫痫发作次数； 疗组慢性期癫痫发作次数 图 2 丘脑底核 疗组癫痫发作频率治疗期癫痫发作频率变化结果 图 3 急性期海马脑电图 A：海人酸注射前海马区正常脑电； B：海人酸注射后癫痫急性发作期脑电图 宁夏医科大学硕士论文 附图 20图 4 海马脑电频率分布结果 A：正常大鼠海马脑电频率分布； B：癫痫大发作海马脑电频率分布 图 5 癫痫慢性发作期脑电异 常放电类型 A：慢性发作期两类主要异常放电类型， 样放电； 样放电 样放电振幅特征； 样放电振幅特征； 样放电频率分布； 样放电频率分布 宁夏医科大学硕士论文 附图 21图 6 治疗前期海马 征 A：治疗前期海马 B：治疗前期海马 率分布； C：治疗前期高频率信号与低频率信号 7 治疗后期海马 征 A：治疗后期海马 B：治疗后期海马 率分布； C：治疗后期高频率信号与低频率信号 夏医科大学硕士论文 附图 22图 8：海马神经元单细胞 电模式 图 9 海人酸大鼠模型各阶段海马神经元 电频率结果 ：正常大鼠海马神经元 点频率； ：癫痫急性期大鼠海马神经元点频率； ：静止期大鼠海马神经元 点频率； ：慢性发作期大鼠海马神经元 点频率 图 10 癫痫慢性发作期癫痫对照组与 疗组海马神经元 电频率比较结果 ：丘脑底核 疗组； ：癫痫对照组 宁夏医科大学硕士论文 附图 23图 12 海人酸引起大鼠海马神经元的凋亡坏死与增生及 保护作用 常大鼠海马（ 40）； 常大鼠海马齿状回神经元（ 200)； 常大鼠海马 神经元 (200X)； 痫大鼠海马（ 40） 痫大鼠海马齿状回神经元（ 200)痫大鼠海马 神经元 (200X)； 疗组大鼠海马（ 40） 疗组大鼠海马齿状回神经元（ 200)疗组大鼠海马 神经元 (200) 宁夏医科大学硕士论文 附图 24图 11 海人酸下调大鼠突触外 体 亚基及 抑制的作用 受体 亚基的分布与表达 A:正常组大鼠突触外 体 亚基的 分布与表达； B：癫痫组大鼠突触外C：治疗组大鼠突触外 体 亚基的分布与表达 表一 海马在 疗各阶段不同频率 范围平均 表二 突触外 体 亚基在海马齿状回与丘脑腹外侧核的表达强度 区域 正常组 （ n=8） 癫痫组 （ n=8） 疗组 （ n=8） 海马齿状回 脑腹外侧核 率范围 癫痫 n=8）治疗前期 n=8） 治疗后期 n=8） 低频率（ 020 频率（ 20100 夏医科大学硕士论文 参考文献 25参考文献 1 W, , P, et 002 . 2005;46:11331139. 2 , M, W, et in a . 1992;42:19111917. 3 J. . 2005;181:36 4 , , . 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