【毕业学位论文】（Word原稿）农杆菌介导猪瘟囊膜糖蛋白基因E2转化马铃薯的研究生物化学与分子生物学学位论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 农杆菌介导猪瘟囊膜糖蛋白基因 化马铃薯的研究 of 2 s of 2 I 摘 要 猪瘟是对养猪业危害严重的一种 A 类传染病，其致病源是猪瘟病毒（ 膜糖蛋白是 主要保护抗原蛋白，应用真核细胞表达系统表达 白免疫动物，对强毒的攻击有很好的保护作用。 实验将马铃薯茎块特异表达启动子 动子与猪瘟病毒囊膜糖蛋白基因 接起来，并克隆到植物核 转化载体 ，构建猪瘟病毒 因的马铃薯特异表达载体 载体含有：抗性基因（ , 茎块特异表达启动子（ 及目的基因（猪瘟病毒囊膜糖蛋白基因 将带有目的基因的载体质粒 入农杆菌，用其浸染马铃薯叶片，诱导再生后，获得抗 生植株。 测， 交结果表明外源基因已经整合到再生植株基因组中。 关键词：猪瘟囊膜糖蛋白基因 动子，转化，马铃薯 is a to is is 2. by 2 2 by is to as 2 . 2 on on 2 of 2 录 第一部分 文献综述 1 瘟病毒及其疫苗简介 1 用转基因植物生产口服疫苗的研究概述 4 第二部分 论文的设计思 路及实验方案 15 义及研究现状 15 16 术路线 17 第三部分 研究报告 18 瘟病毒 因表达载体的构建及序列分析 18 料和方法 18 果与分析 22 论 26 铃薯的转化及转化马铃薯植株的获得 27 料与方法 27 果与分析 35 论 38 结论 39 参考文献 40中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 1 第一部分 文献综述 瘟及其病毒与疫苗的简介 猪瘟是热性全身性败血性传染病，以很强的传染性和高致死率为特征。病程从急性到慢性多种多样。该病给养猪业带来严重危害，国际兽疫局把它列为 A 类疫病。全世界每年由此造成的经济损失以亿计数。 猪瘟在欧洲称为古典猪瘟， 1885 年， 将病原认为是霍乱沙门氏菌，所以又称猪瘟霍乱，其名沿用至今。猪瘟病毒 (称 属黄病毒科 (病毒属 (是世界上损害养猪业的重要病原之一，猪瘟病毒粒子呈球形，直径为 40 60脂双层囊膜，囊膜表面有囊膜糖蛋白突起。在蔗糖中的浮力密度为 降系数 50。不能凝集鸡、豚鼠、猪、牛和人的红细胞。其核衣壳由单独衣壳蛋白组成，超薄切片中呈六角形，可能具有 20 面体对称性（王宁等，1999）。 疫苗接种是控 制猪瘟病毒病发生的主要手段， 我国早在 60年代就研制成功了享誉世界的猪瘟兔化弱毒疫苗，在我国和其它以防治为主的国家的 而，近年来 遍出现免疫失败的现象，因此，根除 随着猪瘟流行病学、分子生物学及分子免疫学领域的发展，猪瘟病毒基因工程疫苗研究的前景诱人。 瘟病毒的分子生物学 病毒的性质和特征： 小的有包膜的 毒，核衣壳为非螺旋的二十面对称结构，直径 4060因组为一单股正链线状 有感染性，沉降系数 40 50s，分子量 4 106U，长度 5非编码区（ 5,一个开放阅读框（ 3非编码区（ 3成。且 5端无帽子结构， 3端无 )尾巴（张靖飞， 2002）。 因组编码蛋白的结构与功能： 因组含有一个 个编码含 3898 个氨基酸，分子量约 438多聚前体蛋白，此前体蛋白进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下被加工成 衣壳的核心蛋白 C，3 种囊膜糖蛋白 此外，还包括 3 5 个非结构蛋白 编码顺序见图 1， 被加工成 除 C， 们均由 结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 2 5373 11694898 |243 结构区 | 非结构区 1 因组示意图 子量约 23结构上与木瓜样胱氨酸蛋白酶类似。 聚蛋白的成熟过程中催化它自身同核衣壳 C 蛋白的分离 ， 而与 游蛋白质的成熟可能有关。 C 蛋白 N 端为 C 端为 由 99 个氨基酸组成 ， 是 衣壳蛋白。 N 末端为 C 末端为 由 227 个氨基酸残基构成，其糖基化程度很高，九个可能的糖基化位点均被糖基化，糖基化前后的分子量分别为 44 48诱导产生中和谱很窄的中和抗体。 有疏水的膜锚定结构 (其在由细胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒颗粒囊膜上并不稳定，在细胞培养 毒的上清液中含有少量的病毒粒子，但却含有大量被分泌出的 仅是一种结构蛋 白，而且也是一种功能性蛋白，它与 993)。 ）活性，与细胞外 和植物自我不适应型 具有很高的同源性，可降解病毒和细胞的et 994)； 导致免疫抑制，引起动物的淋巴和上皮细胞凋亡。 宿主嗜性也与 关，用 有效阻断 易感动物细胞的感染。这表明可能在 细胞的感染过程中起重要作用。 表现出神经细胞毒性和抗凝集活性，由于 有 可分泌蛋 白。 染动物后所产生的 白在其致病过程中起重要作用。 N 端为 690， C 端还未明确确定，但研究表明 C 端位于多聚前体蛋白的 1060氨基酸处，共编码 370 个氨基酸残基，含有 5 个潜在的糖基化位点，分子量约为 53 552 参与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护免疫的抗原决定簇（ et 993）。 因编码的 白是猪瘟的主要保护性抗原，其空间构型由三个疏水区和三个 近 C 端的疏水区为 856 位半胱氨酸（ 后的第 6个氨基酸至 C 端 间形成有弹性的 螺旋结构，没有抗原决定簇。从 N 端 693 位至 856位 间形成富含抗原决定簇的两个抗原结构域，这两个结构域由位于 737 和 792 位 间的一段 片层结构隔开。 693 和 737 位 成二硫键并组成一个序列非保守性抗原结构域，具有中和性的 B、 C 抗原区位于该结构域中，另一个结构域属序列保守性，由 792 和 856 位 含中和抗原区 A 和非中和抗原区 D， A 和 D 区由其间的一个疏水区和818 位、 828 位 成的二硫键分开 (et 990)。在 A、 B、 C 三个中和区中，各有一段与中和性密切相关的高频突变序列或位点。这些序列或位点的突变株将逃脱中和性单抗的中和作用，免疫血清对这类突变株的中和作用也会降低。在全部的 构蛋白中， 起的8 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 3 抗体中和效力最强，但由于 同的 隆所编码的 所差别，且 抗原性也随适应性而发生突变，给 应用带来了一定的困难。近几年关于 基因工程苗取得了一定的进展。 白（ 分子量为 三个糖基化位点，修饰后分子量为 33 C 端有疏水氨基酸 残基的伸展结构，第一个从 二个从 作为跨膜结构蛋白中分子量最小的一种，一般认为 包埋于病毒的囊膜中，不能刺激机体产生中和抗体。在 染细胞的提取物中， 与 异源二聚体的形式免疫共沉淀（ 1993）。由于 能刺激机体产生中和抗体， 所以目前关于 研究还比较少。 瘟疫苗的研究 基因工程亚单位疫苗 利用真核细胞高效表达系统来表达猪瘟病毒免疫原蛋白，并以此表达产物为抗原可制造疫苗。杆状病毒 胞系统可高水平表达外源蛋白，昆虫细胞对蛋白质的加工和运转过程与哺乳动物类似，所表达的蛋白“ 仿真”程度较高。有人将猪瘟病毒 因 组入核型多角体病毒（ 并在 获得纯化的 白， 用 20 100抵抗 100诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗产生的水平（ 余兴龙， 2000） 。 病毒活载体疫苗 以无致病力或低毒力的痘苗病毒（ 伪狂犬病病毒（ 载体，将猪瘟病毒 疫动物后可 对两种病毒产生良好的保护力。 等将编码 到 有 基因）、 有 0 缺失大部分 因）。用 抗体，并可完全抵抗 种的猪，在 天有发烧症状，但随后 2天则完全康复；而用 明 亚单位疫苗，而核心蛋白 用 达了 白，筛选获得了 3 种重组病毒中 码的 乏跨膜结构域，用不含 因的 对照，免疫原性和保护力实验获得了良好的结果，注射 性滴度较低，虽然抵抗了 致死性攻击，但出现了病毒败血症和严重的疾病；而注射 清学检验也为阴性。 对此类疫苗的安全性和实用价值目前还有争议，因为人类至今还不了解病毒的自然发生及 变异机制，也就无法控制这类“人造”病毒的未来走向，一旦将该病毒放入自然界中，将有可能衍变出对人、兽有危害的病毒变种。另一方面，伪狂犬病是较为普遍的一种疾病，猪瘟伪狂犬病重组疫苗对于已感染或已免疫的动物不能产生保护力。 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 4 苗 苗是近年发现并形成的一种新的疫苗研究技术，已有许多用该技术将一些具有药用价值的活性蛋白基因与载体重组，注射动物后成功产生活性蛋白的例子（ 陈创夫， 2001） 。以配有原核复制元件和真核表达调控元件的质粒为 载体，将免疫原基因插入该质粒中，用裸 保证 该重组子在注射动物后不会发生散播，即不具有传染性的同时，该重组子在动物体内对细胞的转染率及在细胞内的表达水平将影响该疫苗的免疫效 力 (P 2002)。由于该重组子可通过发酵培养方式大量制备，又具有相对较好的稳定性，并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因，因此，这项制疫苗技术具有很大的研究价值。 记疫苗 标记疫苗是在分子水平上，将具有选择性标记的基因，克隆到致弱病毒全长 ，免疫动物经测定，可以区分抗体来自于自然感染还是标记基因疫苗，从而断定动物的发病情况。 株 后构建重组体进行表达，将表达的 样改造后并确知其抗原性质的 产生的抗体就可以用简单的血清学方法与野毒感染产生的抗体加以区别。 用转基因植物生产口服疫苗的研究概述 随着转基因植物技术的日益成熟，植物体正成为具有重要经济价值的药用蛋白，抗体和疫苗的生物反应器。科学家将激发机体免疫反应的病原体基因分离出来，重组到植物体中，生产出能够使人体获得特异抗病能力的食用疫苗，并使其基因产物在植物的食用部位表达积累，人们通过吃转基因水果或某种食品 就可以获得抗原蛋白，从而产生抗体达到预防疾病的目的 （曲志才等 2002） 。 点 植物作为生产药用蛋白的生物反应器，为人类和动物提供了一个更加安全和廉价的生产体系，与微生物发酵，动物细胞和转基因动物等生产系统相比，它具有许多潜在的优势（任志强等 2003）：（ 1）成本低廉，不需要复杂的医疗设备；使用方便，可供人直接服用或饲喂动物，易于推广。（ 2）植物具有完整的真核细胞表达系统，能准确地进行翻译后加工。（ 3）无需象传统方法（如发酵法）生产疫苗那样进行提取纯化，可直接食用免疫。（ 4）比传统的免疫途径更有效，植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，刺激黏膜和全身免疫反应。（ 5）安全性好，不需要注射器和针头之类的设备。（ 6）大范围给药，可用于人，家畜和野生食草动物等。（ 7）易于贮存和分发，不 需要冷藏设备。 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 5 服疫苗的免疫作用机制 动物及人体的呼吸道、消化道及生殖道黏膜与病原体接触后会引起机体的黏膜免疫反应，在黏膜的微环境中产生分泌型 体和特异的免疫淋巴细胞，从而构成机体防御病原体感染的第一道屏障。口服疫苗就是以胃肠道黏膜为接种免疫部位，从而使 机体在胃肠道黏膜产生局部免疫应答进而获得全身性的免疫保护 (et 1999)。 现在研究表明，哺乳动物肠道黏膜表皮细胞及肠相关淋巴样组织（ 但构成了抵御病原体感染的保护屏障，而且还是口服疫苗抗原吸收的有效通道 ( 998)。 道黏膜表层的集合淋巴小结（派伊儿结， s 小的孤立淋巴结组成， s 小结内含丰富的淋巴细胞和高度内陷的肠上皮细胞（ M 细胞）。病原体首先被 s 小结内的M 细胞摄取、消化，然后转交 给下层的抗原递呈细胞 (包括巨噬细胞（ 树突状细胞（ 抗原递呈细胞表面有识别特异抗原的结合受体（ 体等），如识别革兰氏阴性菌脂多糖（ 体，识别细菌 元的 体 (et 2000)。抗原递呈细胞获取抗原后，迁移至淋巴小结（ 行抗原的加工和递呈，同时伴随着多种免疫调控因子 (表达，包括白介素 1 和 12，肿瘤坏死因子 、主要组织相容性复合物 （ ）等。 淋巴组织中成熟的 胞在抗原递呈细胞表面的抗原决定簇 - 复合物以及免疫调控因子的共同作用下发生活化，协助 B 淋巴细胞产生中和抗体以及进一步激活巨噬细胞杀灭病原微生物。一部分被激活的 B 淋巴细胞迁移到肠系膜的淋巴结内发育为浆细胞 (接着迁移到黏膜层分泌聚合免疫球蛋白 聚合免疫球蛋白 越消化道黏膜表皮层伸入内腔，裂解为分泌型 够 抵御消化道内蛋白酶的水解，并与特异的抗原表位结合从而中和侵入的病原体。 机体中最丰富的免疫球蛋白，在防止呼吸道和消化道感染方面具有重要的作用 (et 1999)（ 如图 2所示）。 口服疫苗诱导机体产生的抗体主要是 体液中的 会随之产生。要参与机体的体液免疫保护，但其对防止病原体黏膜感染也是有效的，另外 是反刍类动物黏膜分泌液中的主要免疫球蛋白。现在发现黏膜表皮细胞能够表达 和型 组织相容性复合物（ ），这样可直接把 病原体抗原递呈给 T 胞，进而激活了机体的 B 淋巴细胞和细胞毒性 T 细胞反应（ (et 1998)。 因此机体的消化道黏膜组织可成为免疫佐剂和疫苗运送系统的作用目标。 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 6 图 2 病源体诱导机体消化道黏膜免疫反应示意图 消化道内的病原体被 s 小结内的 M 细胞摄取，交给淋巴小结 (的抗原递呈细胞加工，然后激活 T 胞。 B 淋巴细胞在 T 胞和细胞因子作用下活化，发育为浆细胞 (接着迁移到黏膜层分泌聚合 越黏膜表皮层，裂解为分泌型 (图片引用 002) of in s to in of is to is as (002) 服疫苗免疫与机体免疫系统的关系 机体的黏膜免疫是一个相互作用的网络系统，疫苗口服后，先激活肠道黏膜免疫细胞，随后在呼吸道、生殖道、乳汁、唾液中也会诱导产生特异性分泌免疫球蛋白 (例如口服免疫接种活性衣原体疫苗，在机体的生殖道、呼吸道及肠道中都发现了特异的 体，类似的结果还出现在小鼠口服免疫假单孢杆菌的实验中。这表明口服免疫某种疫苗后，若机体的黏膜表面再暴露接种该疫苗抗原可能会诱发更加强烈的免疫反应 (et 1994)。 最近研究人员对于黏膜和肌肉注射联合免疫接 种进行了研究。例如比较巴基斯坦和瑞典妇女肌肉注射霍乱疫苗后发现，原先消化道黏膜感染过霍乱的巴基斯坦妇女的乳汁和唾液中的特异 体滴度有显著的提高，而没有感染过霍乱的瑞典妇女在其黏膜分泌物中则没有高水平中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 7 的 体滴度。其它的研究也表明口服免疫会对之后的注射免疫效果有积极的影响 (et 2001)。从另一方面来看，消化道黏膜免疫系统对食物性抗原具有免疫耐受性，这种免疫耐受性能够防止机体对肠道内的共生菌及食物蛋白产生免疫反应 (et 1998)。抗原的免疫耐受与 抗原的剂量、免疫时间周期及抗原特异性都有密切的关系。如果机体在恰当的时间段内，多次摄入口服疫苗，那么再注射接种该疫苗时，机体对该抗原的免疫反应会比较迟钝（免疫耐受）。因此机体摄入的口服疫苗是能够强化系统免疫应答还是诱导其产生免疫耐受，应对其作进一步的免疫评估。 物转基因疫苗的产生步骤 利用植物生产转基因疫苗一般程序是 ： 1 克隆特异中和抗原的编码基因； 2 构建植物表达载体，把基因整合到植物表达载体上，或利用重组病毒作为载体； 3 利用各种转基因方法，将抗原基因转入植物体使植物带有编码抗原的基因； 4 进行愈伤组织的诱导和分化及转基因植物的再生，使抗原蛋白基因在植物中表达； 5 进行表达水平的检测和免疫原性的测定； 6 进行食品安全性评价，检测。 常用的两种转基因策略 ： 一种途径是用重组病毒感染植株，使其在复制时将转移基因表达于宿主植物，最常用的两个宿主：病毒系统是烟草 烟草花叶病毒草（ 统和豇豆豇豆花叶病毒（ 统。 另一种途径是将抗原基因构建在植物表达载体上，利用农杆菌或基因枪介导的方法，将抗原基因转化到植物系细胞中并与基因组整合，获得稳定表达的转基因植株（ 朱国萍等 2002）。 核转化植物 植物病毒载体 外源基因的表达方式 稳定表达 瞬时表达 外源基因的整合位置 稳定整合入植物基因组 稳定整合入病毒基因组 重组抗原的合成位置 在植物细胞核内表达 随着病毒的复制在植物细胞质内表达 子代的遗传情况 遗传给子代 不遗传给子代 宿主植物的范围 限于单一的转基因植物 可用于对病毒易感的所有植物 表达周期 1 1 扩繁周期 1 年 1 生产成本 高 低 表 1. 两种植物表达载体的比较 of 国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 8 杆菌介导的基因转化机制 在近几年来，农杆菌一直是世界各国科学家研究的热点，与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：一种为根癌农杆菌，它含有 粒，能诱导被浸染的植物形成肿瘤，即诱发产生冠瘿瘤，另一种为发根农杆菌，它含有 粒，能诱导被浸染的植物细胞产生毛发状根，形成 茎瘿瘤（王丹， 2002）。 粒上有一段转移 农杆菌浸染植物时，这段 以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。 转移是指 粒上的转移 加工 ，切割，复制，越过细菌膜以及植物细胞并整合到植物基因组的全过程，植物基因转化必须有 因即毒性区两部分的参与。 边界序列和 域是 转移和整合进植物所不可缺少的，有的农杆菌如胭脂碱型农杆菌系的 粒上为单一的有左或右各一个边界序列，而在章鱼碱型的 则有四个边界序列，其中一个 24超驱动序列起增强子的作用。 粒的 大小为 30 B， C， D， E，G， H 等 7 个操纵子一共有 24 个基因共同控制着 加工和转 移，他们总称为调控子。白被激活后与各 因 5， 端非转录区的“毒性盒”序列相结合，启动各毒性区的转录，组成 合物向植物转移的膜通道，以类似于细菌转导过程的方式到达植物细胞内，并向植物核运动。 由于 因在植物基因转化中起细菌膜以及进入植物细胞并跨入核内起不可缺少的作用。因此，在建立载体时必须含有完整的 因。此外，该载体含有 边界序列，而且这个质粒还能在大肠杆菌和农杆菌之间进行穿梭。目前，在植物基因转化中应用最多的是 粒载体系统，其中双元载体系统最常见，该 载体在一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒，一个质粒含有 外源基因重组的多功能克隆重组载体质粒。该质粒均能在大肠杆菌和农杆菌中进行复制，并能以大肠杆菌中迁移到土壤农杆菌中，另一个质粒是含有 因的 目的基因在连接酶作用下与双元载体连接后，转化至大肠杆菌中，大量增殖后，分离，纯化并迁移到根癌农杆菌中，然后在含有抗生素的选择培养基上与相应的植物细胞（待转化的植物宿主）共同培养，在癌农杆菌（含带有目的基因的双元载体）介导下，目的基因整合到植物细胞核染色体中，并随同植物的遗传而获得稳定 的遗传性状。 物转基因口服疫苗的发展现状和展望 于 1992 年首次报道用转基因植物生产疫苗（乙肝表面抗原）。此后有 于 1998 年利用转基因植物生产口服霍乱毒素 B 亚单位疫苗 :在 1998 年应用转基因表达传染性胃肠炎冠状病毒的免疫球蛋白的多肽； 在 1995 年也成功表达了口服用大肠杆菌耐热肠毒素（ 在 1996 年在烟草和马铃薯中表达了 毒衣壳蛋白；中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 9 1995 年等在番茄中表达了狂犬病病毒糖蛋白； 于 1995 年表达的流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原； 于 1998 年表达了犬细小病毒抗原（ 表达了水貂肠炎病毒抗原（ 目前已报道可作为口服疫苗的仅有： 乙肝口服疫苗， 的狂犬病毒糖蛋白， 的 构蛋白。 大肠杆菌口服疫苗 美国植物病理学家 从 1992 年开始着手对大肠杆菌热不稳定肠毒素 B 亚基（ 植物中的表达进 行研究，他们将编码大肠杆菌热不稳定肠毒素B 亚基（ 结构基因通过根癌农杆菌的介导，完成了对烟草和马铃薯的转化，用 原，同时用 记试验在烟草叶片的提取物中也检测出了 原。每次用 5 克马铃薯块茎或其提取液饲喂小鼠，每周 3 次，连续一个月后，其血清和粪便中分别检测出了特异性的 疫攻毒试验表明，饲喂了该转化植物的鼠可抵抗大肠杆菌的攻击。同时，将 基基因在香蕉中进行表达，可通过食用香蕉而获得对大肠杆菌的保护作用 。同样，美国 究所的细胞生物学家 在田间精心培育出能预防由与 构和功能相似的霍乱毒素（ 起霍乱的苜蓿，他利用土壤农杆菌把霍乱毒素的无毒性 链将其培育成秧苗，食用这种苜蓿后，其中的霍乱毒素 链将很快被位于咽喉，胃肠等部位分泌性粘液细胞所摄入，刺激特异性抗体的大量产生，这样今后仅需摄食这种苜蓿就可获得对致命性霍乱的免疫。 毒衣壳蛋白烟草及马铃薯口服疫苗 美国生物学家 于 1996 年用转基因烟草和马铃薯植物表达 毒衣壳蛋白，该 蛋白可从转基因烟草抽提出以 38毒样粒子形式存在。这种 毒样粒子的重组体（ 源于杆状病毒重组体，这种植物表达的 行口服免疫小鼠。如用饲法（强制喂食，由管灌入胃内）饲养烟草叶抽体物，该鼠血清 体和分泌型 体，如用表达马铃薯茎块直接喂养小鼠，可产生特异性的全身性抗体 此该项实验证明可通过口服同样可产生全身性抗体反应。 白苜蓿口服疫苗 1999 年在病毒学杂志发表了苜蓿转基因植物表达的 构蛋白在鼠体内的保护性抗体反应的研究报告，该学者将 因克隆至双元载体中，在根癌农杆菌的介导下，转化到苜蓿植物中，用叶抽提物经肠道外途径或用新鲜采集的转基因植物叶饲喂老鼠均可产生的特异抗体均可与 氨基酸决定簇的人工合成多肽 构蛋白以及整个 子起反应。 表 2 列举了近十年植物性来源疫苗的研究情况。 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 10 年份 免疫性抗原 转化植物 表达水平 疫苗的免疫原性 及保护能力 参考文献 1990 链球菌表面蛋白抗 原 烟草 ( 990) 1992 乙肝表面抗原 烟草 射后产生免疫 反应 (et 1992) 1995 狂犬病毒糖蛋白 番茄 (et 1995) 1995 大肠杆菌热不稳定 内毒素 烟草 马铃薯 服后产生免疫 反应和保护 (et 1995) 1996 诺沃克 (毒衣壳蛋白 烟草 马铃薯 服后产生免疫应答 (et 1996) 1997 乙肝病毒表面抗原 马铃薯 服后产生免疫反应 (et 1997) 1998 大肠杆菌热不稳定 内毒素蛋白 马铃薯 服后产生免疫 反应和保护 (et 1998; et 1998) 1998 霍乱毒素 B 亚基 马铃薯 服后产生免疫反应和保护作用 (et 1998 a) 1998 人胰岛素与霍乱病毒 B 亚基融合蛋白 马铃薯 服后产生免疫 反应 (et b ) 1999 乙肝病毒表面抗原 生菜 羽扇豆 服后产生免疫 反应 (et 1999) 1999 人巨细胞病毒糖蛋 白 B 烟草 (et 1999) 1999 口蹄疫病毒 白 紫花苜蓿 口服和注射都产生免疫反应和保护 (et a) 2000 呼吸道合胞体病毒 F 蛋 白 蕃茄 10ug/g 果实鲜重 口服后产生免疫 反应 (et 2000) 2000 猪可传染性肠胃炎病毒 S 蛋白 紫花苜蓿 射接种产生免疫反应 (et 2000) 注： 表可溶性总蛋白。 表组织鲜重 表 2. 植物性来源疫苗的种类 . in 国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 11 以上转基因植物疫苗经口服后可诱导机体产生全身性保护性抗体反应。这种利用植物作为生产疫苗的生物反应器， 于微生物发酵，动物细胞和转基因动物等生产系统相比，具有许多潜在的优势。如微生物系统不能对真核生物蛋白进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化；细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物，而将这些聚合物重新溶解并折叠成天然蛋白质，需要高的成本；动物细胞培养所需要培养基相当昂贵；转基因动物则受伦理关注。利用转基因植物生产口服疫苗可避免或至少减免部分纯化过程，这样就降低了生产成本，对负担不起目前的一些昂贵的疫苗发展中国家，植物口服疫苗更加具有巨大的潜在市场的诱人前景。但是，依目前的研究成果来看，应用植物表达的口服疫苗其产量低 下，难以获得高水平的表达，当然在今后的研究中可通过：（ 1）适当的启动子，增强子和前导序列的选择（ 2）密码子的优化（ 3） 稳定序列的去除（ 4）选用其它植物种（ 5）整合非依赖性表达（ 6）通过修饰外源蛋白基因将其定靶于细胞的不同空间（ 7）以及通过协同表达二硫键异构酶或伴侣蛋白促进蛋白质的正确折叠，通过以上这些方法可尝试提高蛋白产量。 转基因口服疫苗植物遗传性状的评估 转基因口服疫苗植物是否已获得了稳定的含外源蛋白基因的遗传性状，可通过检测转化植物中是否含有可表达的外源基因和该外源基因所表达的相应产物来评估 。这些技术是分子生物和免疫学中最常用的技术。这些方法可在建立转化中的外源基因是否存在和拷贝数的多少可应用 交方法：在外源基因选择相应的植物宿主表达外源蛋白中，烟草植物因可产生大量外源蛋白而首先被采用，但由于烟草中含毒性碱纯化后才能食用，故一般采用口感较好的香蕉和西红柿来表达人用口服疫苗，而用一些如苜蓿，谷类植物，大豆等来表达动物用口服疫苗。 在的问题及未来研究的展望 目前看来，转基因植物表达水平通常低于可溶性总蛋白含量的 1%，这样便削弱了植物载体生产医用蛋白的市场应用前 景。因此如何提高转基因植物中目的蛋白的含量是今后研究的主要问题。我们可以通过优化基因的密码子模式、选择表达产物的细胞定位以及在植物特异组织中积累从而提高目的蛋白的表达量。 外源基因的优化 植物利用密码子的偏爱模式不同于动物，因此选用植物优先使用的密码子可以增加外源基因的翻译效率。例如 et (1998) 构建了适合植物表达的合成基因，从而提高了大肠杆菌内毒素 B 亚基在植物中的表达水平，利用合成基因会使该抗原在叶片和植物组织中的含量提高 3。 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分文献综述 12 蛋白的细胞内定位 我们研究植物细胞内蛋白 的定位机制也会有助于提高重组蛋白在植物中的表达水平。人们已经观察到当重组抗体被分拣到细胞分泌途径而不是定位在胞质时，其表达量会显著提高，若把蛋白定位到内质网还会得到更高的表达量 ( 998)。如王新国等研究人员在转基因烟草中，将霍乱毒素 B 亚基（ 因的 3 端引入内质网引导序列 肽序列，从而大大提高了重组蛋白的含量 。 蛋白在植物种子和特异组织中的累积 早期表达重组蛋白的植物载体通常是常规的转化植物，如烟草、马铃薯等。这些茄科植物虽然容易进行基因转化，但是 其蛋白的含量比较低，并且还含有毒的次生性代谢物，所以作为重组蛋白的生产载体并不理想，而比较理想的植物载体应含有丰富的可溶性蛋白，并且能够长期保存。农作物的种子便具有上述的特点，特别是种子胚部分富含可溶性蛋白，并且种子蛋白比较容易分离纯化，这样便能够浓缩重组抗原蛋白，可使其剂量化。例如在玉米中表达的大肠杆菌热不稳定内毒素 B 亚基可食用疫苗，经加工处理后利用玉米胚部分可制成 1 口服疫苗，并且提高了疫苗的口感和耐储存能力 (et 2001)。马铃薯的块茎也被用作储存重组蛋白的场 所，例如 et (1996)将马铃薯块茎特异启动子（ 动子）驱动诺沃克病毒衣壳蛋白（ 因的表达，结果在转基因马铃薯微块茎中， 最高含量为可溶性蛋白量的 明显高于外源基因在烟草叶片中的表达水平。 中国农业科学院硕士学位论文